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TMB 法*雜交試劑盒5次說(shuō)明書(shū)

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TMB 法*雜交試劑盒5次說(shuō)明書(shū)一般使用0.1×SSC做洗膜液,在此條件下的洗膜溫度比 Tm 低 5-12℃,一般情況下可以在 55℃進(jìn)行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。

TMB 法*雜交試劑盒5次說(shuō)明書(shū)步驟:
1. 如果標(biāo)記的探針是雙鏈核酸,則需經(jīng)變性處理。具體操作是:根據(jù)探針濃 度和雜交所需探針的量計(jì)算出所需的探針體積,取出所需體積的探針到一 干凈的硅化的塑料離心管中,加入等體積的本產(chǎn)品,吹打混勻后室溫放置 5 分鐘變性后,將探針樣品放入冰浴中冷卻,加入 0.05 倍體積的自備的 1 M Tris-Cl 溶液(pH 7.2)以及等體積的自備的 0.4 M HCl 溶液。 將探針樣品保存在冰浴中直至需要。如果是單鏈 DNA RNA 探針,則 不需變性,直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預(yù)雜交的雜交袋中(先用剪 刀剪一小口,加入探針后用熱封機(jī)封口)。探針的加入量視探針標(biāo)記效率 而定,一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測(cè)基因組中的單拷 貝基因,探針的加入量應(yīng)加大,而對(duì)于檢測(cè)克隆的基因片段,則探針的量 可減少。如果是放射性探針,應(yīng)將此塑料袋套在另一塑料袋之中,以避免 雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。
3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫,時(shí)間一般為 6-12 小時(shí)。 六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過(guò)程中,一定不要使印跡。

TMB 法*雜交試劑盒5次說(shuō)明書(shū)使用方法:
一、交換反應(yīng) 1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑:7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2. 在微量離心管中制備下列反應(yīng)液.
3. 37
反應(yīng) 30 分鐘。
4. 70加熱 510 分鐘使酶失活。
5. 加入 10 μL 7 M CH3COONH4pH 4.5)。如使用 CH3COONa 乙醇沉淀時(shí)使其終濃度達(dá) 300 mM。
6. 加入 87.5 μL2.5 倍)的冷無(wú)水乙醇,-20放置 3060 分鐘。
7. 離心回收沉淀,用 70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。
8. 用適當(dāng) Buffer 溶解沉淀。 注:通過(guò)第 58 步操作幾乎可以除去大部分未反應(yīng)的[γ-32P] ATP,如要 *將其除去時(shí),乙醇沉淀后用凝膠過(guò)濾等方法精制即可。如需用*抽 提除去蛋白質(zhì)時(shí),請(qǐng)?jiān)诘?/span> 8 步之后進(jìn)行。
TMB 法*雜交試劑盒5次說(shuō)明書(shū)確定洗膜溫度:
一般使用 0.1×SSC 做洗膜液,在此條件下的洗膜溫度比 Tm 5-12,一般情況下可以在 55進(jìn)行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。 四、預(yù)雜交步驟 預(yù)雜交就是用不含探針的超級(jí)雜交液跟印跡膜進(jìn)行孵育,其目的是用所含 的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印 跡膜上會(huì)非特異地吸附探針?lè)肿拥奈稽c(diǎn)封閉,否則這些位點(diǎn)會(huì)吸附標(biāo)記的探 針,造成高背景。
1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6× SSC 溶液中,使其充分濕潤(rùn)。
2. 將濕潤(rùn)的印跡膜置于一塑料雜交袋中(塑料袋預(yù)先封口,再剪掉一角, 留一個(gè)小口),按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級(jí)雜交液的比例沿小口 加入超級(jí)雜交液,然后用塑料封口機(jī)將口封牢。 3. 將此塑料袋浸沒(méi)入溫度設(shè)定在雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中,保 1-2 小時(shí),延長(zhǎng)到 12-16 小時(shí)亦可。注意保溫過(guò)程中塑料袋應(yīng)在不停 的搖動(dòng)狀態(tài)中,使超級(jí)雜交液與印跡膜充分接觸。
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