填入法 DNA 末端標記試劑盒 A5次特點詳細說明書：

填入法 DNA 末端標記試劑盒 A5次特點使用方法：
一、交換反應 1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2. 在微量離心管中制備下列反應液.
3. 37℃反應 30 分鐘。
4. 70℃加熱 5～10 分鐘使酶失活。
5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做 乙醇沉淀時使其終濃度達 300 mM。
6. 加入 87.5 μL（2.5 倍）的冷無水乙醇，-20℃放置 30～60 分鐘。
7. 離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。 注：通過第 5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP，如要 *將其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用*抽 提除去蛋白質(zhì)時，請在第 8 步之后進行。
填入法 DNA 末端標記試劑盒 A5次特點確定洗膜溫度：
一般使用 0.1×SSC 做洗膜液，在此條件下的洗膜溫度比 Tm 低 5-12℃，一般情況下可以在 55℃進行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。 四、預雜交步驟 預雜交就是用不含探針的超級雜交液跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含 的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印 跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探 針，造成高背景。
1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6× SSC 溶液中，使其充分濕潤。
2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中（塑料袋預先封口，再剪掉一角， 留一個小口），按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級雜交液的比例沿小口 加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。 3. 將此塑料袋浸沒入溫度設定在雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保 溫 1-2 小時，延長到 12-16 小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應在不停 的搖動狀態(tài)中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。
填入法 DNA 末端標記試劑盒 A5次特點步驟：
1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是：根據(jù)探針濃 度和雜交所需探針的量計算出所需的探針體積，取出所需體積的探針到一 干凈的硅化的塑料離心管中，加入等體積的本產(chǎn)品，吹打混勻后室溫放置 5 分鐘變性后，將探針樣品放入冰浴中冷卻，加入 0.05 倍體積的自備的 1 M 的 Tris-Cl 溶液（pH 7.2）以及等體積的自備的 0.4 M 的 HCl 溶液。 將探針樣品保存在冰浴中直至需要。如果是單鏈 DNA 或 RNA 探針，則 不需變性，直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預雜交的雜交袋中（先用剪 刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口）。探針的加入量視探針標記效率 而定，一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷 貝基因，探針的加入量應加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量 可減少。如果是放射性探針，應將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免 雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。
3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時間一般為 6-12 小時。 六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡。
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S-（4-nitnobenzyl）-6-thioinosine （100 mg）     NBMPR|NBTI|NSC 296962； S-4-nitnopxenylmetxyl-6-thioinosine

RPE-iFluor 647-標記鏈霉親和素偶聯(lián)物 1 mg/ml     RPE-iFluor 647-streptavidin conjugate 1 mg/ml

N-acetyl-3，4-metxylenedioxymetxcathinone （10 mg）     N-

Linoleic Acid （peroxide free） （250 mg）     9Z，12Z-octadecadienoic acid； fairic Acid； Linoleic Acid （peroxide free）

2-（Phosphonometxyl）pentane-1，5-dioi     NAALDase Inhibitor， Pmpe
GLP-1 (9-36) amide (human, bovine, guinea pig, mouse, porcine, rat)Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2

XeninMet-Leu-Thr-Lys-Phe-Glu-Thr-Lys-Ser-Ala-Arg-Val-Lys-Gly-Leu-Ser-Phe-His-Pro-Lys-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu

[Leu31,Pro34]-Neuropeptide Y (13-36) (human, rat)Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2

Biotin-a-CGRP (human)Biotin-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (Disulfide bridge:Cys2-Cys6)

Orexin A, bovine, human, mouse, ratPyr-Pro-Leu-Pro-Asp-Cys-Cys-Arg-Gln-Lys-Thr-Cys-Ser-Cys-Arg-Leu-Tyr-Glu-Leu-Leu-His-Gly-Ala-Gly-Asn-His-Ala-Ala-Gly-Ile-Leu-Thr-Leu-NH2(Disulfide bridge: Cys6-Cys12, Cys7-Cys14)
填入法 DNA 末端標記試劑盒 A5次特點派啶pipeni7ineAR100mL

CA1321-50mg4-(2-安乙基)本磺酰扶 鹽酸鹽(AEBSF)30827-99-750mg0

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