一談到真核遺傳，*基因組僅僅是個起點，此外還有表觀基因組，這種可遺傳的DNA和組蛋白化學(xué)修飾控制著基因組的表達。
5-mC和5-hmc
DNA甲基化就是這類化學(xué)修飾中的一員，甲基化一般發(fā)生在哺乳動物基因組CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基（5-甲基胞嘧啶/5-mC），主要集中于CpG島和基因調(diào)控元件，與基因沉默有關(guān)。
其實人們早在幾十年前就發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化現(xiàn)象，5-甲基胞嘧啶還被稱為DNA的“第五種堿基”，表觀遺傳學(xué)研究者們開發(fā)了大量的分子工具來追蹤和分析它。然而在2009年，兩組研究團隊（洛克菲勒大學(xué)Nathaniel Heintz團隊和哈佛醫(yī)學(xué)院Anjana Rao團隊）同時在Nature雜志上發(fā)表了重要文章，他們發(fā)現(xiàn)了另一種甲基化修飾形式——5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），這無異于在生物學(xué)界投下一枚重磅。
“自2009年以來zui大的變化可能就是，現(xiàn)在大家的研究主要集中在這些DNA甲基化變體上，”Active Motif公司產(chǎn)品Kyle Hondorp說，Active Motif公司是一家以“促進表觀遺傳學(xué)研究”為宗旨的美國公司。
在上述兩篇文章中，研究人員分別在小鼠Purkinje神經(jīng)元和胚胎干細胞中發(fā)現(xiàn)了5-hmC，5-hmC與5-mC在細胞和基因組中的分布不同，5-hmC主要集中在基因片段中。TET蛋白家族的酶對5-mC進行修飾形成了5-hmC。然而，許多傳統(tǒng)DNA甲基化研究方法都無法分辨這兩種類型的修飾，默克密理博的表觀遺傳學(xué)產(chǎn)品Michael Sturges說，這意味著人們需要重新審視過去幾十年的一些甲基化分析。
“這說明在過去15至20年間，人們收集到的數(shù)據(jù)在一定程度上包括了羥甲基胞嘧啶事件，”Sturges的同事，默克密理博的表觀遺傳學(xué)研發(fā)John Rosenfeld說。
5-fC和5-caC
不過，遺傳學(xué)字母表中可不止這六個成員，除了A、C、G、T、5-mC和5-hmC，至少還存在兩種甲基化修飾類型。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)對真核生物的胞嘧啶殘基進行甲基化。Tet1能夠?qū)?-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC，但這種酶并未就此罷手，它能夠進一步將5-hmC氧化成為5-甲酰胞嘧啶（5-fC），甚至再轉(zhuǎn)化成為5-羧基胞嘧啶 （5-caC），這一酶促通路似乎參與了去除DNA 5-mC標志的過程，Rosenfeld說。（該通路的更多信息，請參閱Active Motif的DNA甲基化指引手冊。）
研究以上各種甲基化類型的方法之一就是親和捕獲。標準5-甲基胞嘧啶的傳統(tǒng)研究方法是甲基化DNA免疫沉淀MeDIP和MIRA（methylated CpG island recovery assay），這兩種方法分別利用抗5-mC的抗體和甲基化DNA結(jié)合蛋白 （MBD）來捕獲被修飾的DN段。而現(xiàn)在，研究人員也同樣能夠使用特異性抗體對5-hmC進行研究。
目前包括默克密理博在內(nèi)的許多公司都提供抗5-hmC的抗體，Active Motif當(dāng)然也不例外。Active Motif將這種抗體打包在hMeDIP（羥甲基化DNA免疫沉淀）試劑盒中，用來捕獲包含甲基化修飾的DNA序列。除此以外，研究者們還可以使用該公司新品Hydroxymethyl Collector™試劑盒來富集含5-hmC的DN段。（Active Motif也為那些對5-fC或者5-caC的研究者們提供了相應(yīng)抗體。）
“Hydroxymethyl Collector是我們?nèi)ツ臧l(fā)布的zui引人注目的技術(shù)，”Hondorp說。
Active Motif公司的MethylCollector Ultra™ 試劑盒是利用MBD2b和MBD3L1來純化甲基化的DNA。而Hydroxymethyl Collector試劑盒則不同，它利用了一種酶——beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（millipore.html' target='_blank'>Millipore也有相應(yīng)產(chǎn)品提供），這種酶能夠特異性的使5-hmC糖基化。這種被轉(zhuǎn)移的葡萄糖基是經(jīng)歷過疊氮化合物修飾的，它能與*相連，使得Hydroxymethyl Collector試劑盒中的鏈霉親和素磁珠能夠捕獲含5-hmC的DN段。
使用hMeDIP和Hydroxymethyl Collector試劑盒得到的都是是DN段的混合物，其中每條片段中都至少含有一個5-hmC修飾。研究人員可以對這一混合物進行測序來得到整個基因組的羥甲基化信息，或者也可以通過PCR進行逐個位點的分析。當(dāng)然這種混合產(chǎn)物還可以用于芯片分析。專門針對甲基化研究的芯片包括：美國安捷倫科技公司的DNA Methylation Human CpG Island芯片和Illumina公司的Infinium® HumanMethylation450 BeadChip等。羅氏NimbleGen也有一款包括10個芯片的Human DNA Methylation 2.1M Whole-Genome Tiling芯片組合，不過據(jù)羅氏應(yīng)用科學(xué)公司的市場部Clotilde Teiling稱，由于NimbleGen準備將重心從芯片領(lǐng)域轉(zhuǎn)到序列捕獲產(chǎn)品，該芯片產(chǎn)品將于今年年底停產(chǎn)。
New England Biolab公司的EpiMark® 5-hmC and 5-mC analysis 試劑盒也是同樣利用beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對5-hmC進行糖基化。不過，這一試劑盒是根據(jù)糖基化后5-hmC和5-mC對限制性內(nèi)切酶的敏感性不同來進行區(qū)分，未糖基化的甲基化位點含有對MspI（5'-C / CGG-3'）敏感的序列，而糖基化的序列則對MspI酶不敏感。
此外還有一種特異性識別5-hmC的酶，限制性內(nèi)切酶PvuRts1I，這種酶Active Motif也有提供。PvuRts1I與含5-hmC的DNA結(jié)合，在相應(yīng)核苷酸位點（9和13）對雙鏈進行切割，得到含5-hmC的24bp片段。用這種酶處理基因組DNA就會得到上述片段的混合物，對這種片段混合物進行測序的效果與MeDIP測序相同，都能夠揭示基因組范圍的5-hmC位點。
重亞硫酸鹽測序
為了達到準確的bp級分辨率，研究人員還需要采取特殊策略。重亞硫酸鹽測序是*的甲基化DNA測序“金標準”。用亞硫酸氫鈉處理DNA能夠?qū)⑽葱揎椀陌奏まD(zhuǎn)化為*，在DNA測序反應(yīng)中zui后顯示為胸腺嘧啶。將該數(shù)據(jù)與未處理的DNA測序數(shù)據(jù)相比對就能夠確定甲基化的位點。
然而，與其他一些甲基化分析方法一樣，重亞硫酸鹽也無法區(qū)分5-mC和5-hmC。不過今年早些時候，研究者們提出了解決這一難題的兩種方法。
其一是Tet輔助的重亞硫酸鹽測序TAB-Seq，這種方法利用TET蛋白的活性將5-mC氧化為5-caC。在用亞硫酸氫鈉處理時，5-caC就像未修飾的胞嘧啶一樣被轉(zhuǎn)化為*。該方法先用beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將5-hmC糖基化保護起來。隨后用TET處理DNA，使其他甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-caC。zui后再用重亞硫酸鹽處理DNA。在測序過程中，所有胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶都被讀為T，而5-hmC仍然為C。將這一數(shù)據(jù)與標準重亞硫酸鹽測序生成的數(shù)據(jù)相比，就能使研究人員確定哪個堿基包含何種修飾。位于芝加哥的WiseGene公司已經(jīng)成功將這一技術(shù)商業(yè)化。
另一種方法是氧化重亞硫酸鹽測序（oxBS-Seq），用高釕酸鉀將5-hmC氧化為5-fC。在用重亞硫酸鹽處理后，5-fC（就像胞嘧啶）測序讀取為T。同理，將標準重亞硫酸鹽處理的DNA序列與oxBS-Seq DNA序列相比對就能夠區(qū)分5-mC與5-hmC。
當(dāng)然，供應(yīng)商們并沒有忽略5-甲基胞嘧啶。用Sturges的話說，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化是“出了名的繁瑣”，需要研究人員把握好試劑、時間和溫度的平衡，才能將胞嘧啶*轉(zhuǎn)化而又不影響到甲基化胞嘧啶。為此，默克密理博發(fā)布了增強版的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，CpGenome Turbo Bisulfite Kit。
據(jù)Sturges介紹Turbo kit物如其名，該試劑盒采用新化學(xué)物質(zhì)和優(yōu)化的反應(yīng)溫度，將重亞硫酸鹽16小時的標準轉(zhuǎn)化流程縮短到了90分鐘。在內(nèi)部測試中，這一試劑盒的轉(zhuǎn)化效率達到了99.9%，并且絲毫沒有發(fā)生過度轉(zhuǎn)化。
定向選擇甲基化DNA
默克密理博公司還發(fā)布了可與Turbo kit配套使用的甲基化DNA富集試劑盒CpG MethylQuest。這種試劑盒用MBD2特異性捕獲含5-甲基胞嘧啶的DNA，并且能夠控制所收集的產(chǎn)物中不含未修飾的堿基或者5-hmC。
安捷倫科技公司也為甲基化DNA的二代測序提供了一款目標富集產(chǎn)品，SureSelect XT Human Methyl-Seq kit試劑盒。該公司基因組學(xué)業(yè)務(wù)部市場副總監(jiān)Yong Yi介紹，與用于目標外顯子測序的SureSelect exome kit類似，該試劑盒能夠有效減少目標區(qū)域的測序成本和測序時間。
“人類全基因組測序成本高耗時長，令不少研究者望而卻步，相比之下外顯子測序的效率就高多了，”Yi說。“我們將這一理念應(yīng)用于Methyl-Seq試劑盒，使Methyl-Seq實驗更有針對性。”
羅氏NimbleGen不提供現(xiàn)成的DNA甲基化目標富集產(chǎn)品，但用戶可以量體裁衣自行設(shè)計，公司能夠為客戶將2.1百萬的探針混合在單個小管中，Teiling說。
該試劑盒包含120-mer RNA餌，用于捕獲人類基因組CpG島、以及“shores”“ shelves”區(qū)域中的甲基化片段。（Shores和shelves分別是指距CpG島邊緣2kb和4kb的區(qū)域，在這些區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了許多差異性甲基化的序列，Yi說。）該試劑盒總共能夠捕獲3.7百萬CpG超過84Mb序列。而安捷倫的methylation-focused DNA芯片是覆蓋整個基因組的27,800 CpG島。 “這是相當(dāng)復(fù)雜而全面的設(shè)計，”Yi說。
當(dāng)然，隨著表觀遺傳學(xué)越來越重要，擴展到的領(lǐng)域越來越多，也許您會被這些五花八門的技術(shù)和方案弄得有些無所適從。不用擔(dān)心，自有公司能為您提供貼心又省心的服務(wù)，這些公司的專業(yè)人員提供的技術(shù)服務(wù)，能為您免去了大量的優(yōu)化工作，節(jié)省寶貴的時間和精力。舉例來說，Active Motif公司zui近收購了GenPathway，這意味著該公司現(xiàn)在能夠提供諸如重亞硫酸鹽測序、生物信息學(xué)分析、hMeDIP等技術(shù)服務(wù)。“現(xiàn)在我們能夠為無法自己進行這類實驗和數(shù)據(jù)分析的客戶提供幫助。”Hondorp說。