微流體PCR和DNA測(cè)序讓我們能夠從大細(xì)胞群中挑出單個(gè)的細(xì)胞進(jìn)行分析。現(xiàn)在研究人員正在生物學(xué)中發(fā)現(xiàn)全新水平的復(fù)雜性。
數(shù)十年來，研究人員一直是對(duì)細(xì)胞群展開分析。人們認(rèn)為構(gòu)成這些細(xì)胞群的單個(gè)細(xì)胞例如干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞差不多是一樣的，細(xì)胞生物學(xué)家們采用的方法獲得的都是這些細(xì)胞群特征的平均值。
德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的遺傳學(xué)助理教授Nicholas Navin 說：“當(dāng)前的方法是整體分析腫瘤，由此報(bào)告來自細(xì)胞群的平均信號(hào)。其缺點(diǎn)在于它可能掩蓋了zui豐富的、也是zui惡性的腫瘤細(xì)胞亞群。”
然而現(xiàn)在，隨著微流體PCR和DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展使得從這些細(xì)胞群中分離出和分析單個(gè)細(xì)胞變得更為容易。而zui讓人驚訝地是，研究人員發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞并不*相同。事實(shí)上，這些細(xì)胞群可能是由帶有極其不同藍(lán)圖的幾種亞細(xì)胞群組成。這一發(fā)現(xiàn)可以幫助癌癥研究人員，例如追蹤轉(zhuǎn)移細(xì)胞。現(xiàn)在，科學(xué)家們正利用新的單細(xì)胞分析技術(shù)去發(fā)現(xiàn)哪些細(xì)胞具有哪些藍(lán)圖，以及是如何影響它們的表型的。
揭露干細(xì)胞的異質(zhì)性
在美國(guó)斯坦福醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)、心臟病學(xué)和放射學(xué)副教授Joseph Wu正在開發(fā)一種集成微流體電路用于單細(xì)胞實(shí)時(shí)PCR。這些設(shè)備僅需數(shù)皮克的RNA就可在單細(xì)胞水平上分析基因表達(dá)。利用這種方法，Joseph Wu和同事們揭示了采用常規(guī)實(shí)時(shí)PCR有可能看起來是一致的細(xì)胞群的異質(zhì)性。
“從前，由于實(shí)時(shí)PCR需要數(shù)百至數(shù)千細(xì)胞的RNA，人們猜想收到相同胞外信號(hào)的一個(gè)細(xì)胞群體會(huì)對(duì)變化做出反應(yīng)，具有相同基因表達(dá)模式。新微流體設(shè)備使得我們能夠在細(xì)胞群內(nèi)逐個(gè)細(xì)胞研究基因表達(dá)，并揭示了對(duì)環(huán)境反應(yīng)可能的細(xì)胞異質(zhì)性，”Joseph Wu說
例如，在近期發(fā)表的一篇論文中，Joseph Wu和同事們利用單細(xì)胞實(shí)時(shí)PCR微流體設(shè)備比較了人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）和人類多能干細(xì)胞（hESCs）的異質(zhì)性。它們發(fā)現(xiàn)相比hESCs在hiPSCs中基因表達(dá)水平差異更大，表明一種不穩(wěn)定的多能狀態(tài)。此外，研究小組還發(fā)現(xiàn)hiPSCs的分化緩慢且不一致，這有可能會(huì)不利于其臨床應(yīng)用。
使癌癥研究受益
德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的遺傳學(xué)助理教授Nicholas Navin將隨機(jī)抽取單個(gè)細(xì)胞遺傳信息比喻為如同投票選舉：它給予了你一種對(duì)群體多樣性的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。“我們想在人類腫瘤中描繪出克隆的多樣性，了解這一參數(shù)在評(píng)估侵襲、轉(zhuǎn)移、存活和對(duì)*的反應(yīng)中是否具有預(yù)測(cè)價(jià)值。利用單細(xì)胞測(cè)序我們能夠在腫瘤中重建這些細(xì)胞系，并了解突變的年表。”
 
為了實(shí)行這種單細(xì)胞分析，Navin實(shí)驗(yàn)室利用了一套系統(tǒng)，包括流式細(xì)胞分選單細(xì)胞或細(xì)胞核、激光捕獲顯微切割、全基因組擴(kuò)增和新一代測(cè)序。“單細(xì)胞測(cè)序?qū)⑸钸h(yuǎn)地改變我們了解復(fù)雜的細(xì)胞群。例如癌癥的方式。”此外，利用單細(xì)胞測(cè)序研究人員還能夠用罕見及有價(jià)值的樣品例如癌癥干細(xì)胞或循環(huán)腫瘤細(xì)胞來開展研究。“在這種情況下，標(biāo)準(zhǔn)方法將不會(huì)有足夠的輸入材料來發(fā)揮功能。不過，在這些工具準(zhǔn)備進(jìn)入臨床應(yīng)用前，仍然需要更多的努力來減少與擴(kuò)增相關(guān)的錯(cuò)誤。”
在冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Navin的前博士后顧問Michael Wigler應(yīng)用演化的觀點(diǎn)來研究了癌癥形成的遺傳學(xué)。研究生Timour Baslan 說：“癌癥研究人員之間有一個(gè)共識(shí)即腫瘤是通過獲得導(dǎo)致失控性擴(kuò)增的體細(xì)胞突變而進(jìn)化的。但對(duì)于這一進(jìn)化過程實(shí)際發(fā)生的機(jī)制普遍缺乏了解。我們的理由是，因?yàn)樽匀贿x擇作用于個(gè)體，因此致瘤過程對(duì)單細(xì)胞發(fā)揮了作用，zui終導(dǎo)致了腫瘤群。因此要全面掌握腫瘤演變必須要了解單個(gè)細(xì)胞。”
Wigler研究小組發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序可以生成不同細(xì)胞類型的有價(jià)值的功能信息。Baslan說：“例如，通過測(cè)序來自成對(duì)原發(fā)和轉(zhuǎn)移樣品的單個(gè)細(xì)胞的基因組，我們確定了在原發(fā)腫瘤中更密切匹配轉(zhuǎn)移性腫瘤基因組標(biāo)記的單細(xì)胞基因組。在這個(gè)特定的實(shí)例中，我們可以推測(cè)出這些單細(xì)胞的功能是種植轉(zhuǎn)移性腫瘤。”Wigler研究小組還利用成像技術(shù)通過表型鑒別了細(xì)胞，進(jìn)而可以將表型與單細(xì)胞基因組信息關(guān)聯(lián)到一起。
解開DNA發(fā)夾
一些可實(shí)現(xiàn)單個(gè)DNA分子測(cè)序的新技術(shù)，即所謂的單分子測(cè)序也迅速地發(fā)展成為了單細(xì)胞分析的工具。單分子測(cè)序的一個(gè)有吸引力之處在于它繞開了擴(kuò)增，減少了時(shí)間、成功和潛在的錯(cuò)誤。一個(gè)例子是ABCD生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究主任、巴黎高等師范學(xué)校（ Ecole Normale Superieure）生物學(xué)和物理學(xué)系教授Vincent Croquette及同事們開發(fā)的一種DNA發(fā)夾測(cè)序技術(shù)。
他們的發(fā)現(xiàn)并非*有意的。“zui初，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)用一個(gè)發(fā)夾來研究DNA復(fù)制，”Croquette說。他們利用磁鑷子“解開”DNA發(fā)夾，DNA發(fā)夾的一端固定在一個(gè)表面。另一端在磁珠上。“DNA發(fā)夾是對(duì)復(fù)制叉的zui小的物質(zhì)，通過磁鑷子可將兩臂拉開。”當(dāng)用磁力將發(fā)夾解開時(shí)，互補(bǔ)寡核苷酸能夠與發(fā)夾鏈雜交，阻止當(dāng)拉力減小時(shí)發(fā)夾再拉上。測(cè)量對(duì)再拉上的阻礙可使他們鑒別出何時(shí)已知的DN片段雜交到了發(fā)夾上。通過利用他們的方法以及一種互補(bǔ)寡核苷酸連接的周期循環(huán)，這種寡核苷酸延伸了與發(fā)夾結(jié)構(gòu)雜交的引物，從而他們能夠獲得一個(gè)未知片段的單分子序列。Croquette說：“我們還必須提高它的通量和讀長(zhǎng)以使其具有競(jìng)爭(zhēng)力。原則上，它能夠處理非常小量的材料，它的確具有單分子靈敏度。”
zui終，單細(xì)胞測(cè)序有可能會(huì)在癌癥的診斷和治療中成為重要的臨床和治療工具。Wigler研究小組正與紐約紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC）的 Howard Scher展開合作，利用臨床試驗(yàn)中來自患者的樣品。Baslan說：“我們正在繪制患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的圖譜。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，我們的目的是將來自循環(huán)細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)與臨床參數(shù)關(guān)聯(lián)起來。”
此外，Wigler研究小組還與俄亥俄州立大學(xué)的Lyndsay Harris一起采用單細(xì)胞測(cè)序作為工具監(jiān)控了患者腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)。Baslan 說：“在未來，有可能會(huì)出現(xiàn)更多的應(yīng)用程序，尤其是更多搜尋患者材料的非侵入性方法。其中一個(gè)例子是我們與MSKCC的Larry Norton博士合作，檢測(cè)了利用細(xì)針抽取研究癌癥基因組圖譜的可能性。我們希望通過以非侵入方式獲得單個(gè)癌細(xì)胞并繪制出圖譜在不久的將來幫助指導(dǎo)臨床中的治療決策。