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熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。熒光顯微鏡以紫外線為光源,用以照射被檢測(cè)物體,使之發(fā)出熒光,然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。細(xì)胞內(nèi)有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖然不發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光。
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,一是具有形態(tài)學(xué)特征,二是具有熒光的顏色和亮度,在判斷結(jié)果時(shí),必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),即憑工作者目力觀察,作為一般定性觀察基本上是可靠的。
隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,采用細(xì)胞分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡和圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果,也必須結(jié)合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要,由于熒光很易減弱褪色,要及時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微鏡攝影技術(shù)基本相同。但需要采用高靈敏度制冷CCD,比如MC21,采用的是大靶面進(jìn)口SONY芯片的高靈敏度CCD,制冷到室溫下25度可以很有效的抑制噪點(diǎn)。
因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大,如FTTC的標(biāo)記物,在紫外光下照射30s,熒光亮度降低50%。所以曝光速度太慢,就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都用冷CCD與計(jì)算機(jī)連接,將圖像存在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)上。
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