操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

商品屬性：

商品介紹：

測定意義

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過程的第一個限速酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。

測定原理：

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

實驗方法學(xué)：

選擇抗凝的注意點：

①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時所取的全血的量也要盡量一致;

②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導(dǎo)致凝固;

③、抗凝全血收集的血漿相對較多（1ml抗凝全血能分離出0.4～0.5ml血漿）;

④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時可能會出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后

用于測定。

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