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產品介紹：

組織細胞microRNA提取試劑盒

描述：生產的組織細胞 miRNA 提取試劑盒是目前世界 上提取小 RNA（<200nt）操作步驟重復性最好、 小 RNA 產率最高的方法。使用該試劑盒提取的小 RNA （Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95% 以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用該試劑通過一步上 柱即可獲得高純度 miRNA，可在 45min 內完成小 RNA 的提 取。該試劑盒廣泛適用于動物組織、細胞和多糖多酚含量不 高的植物組織樣本。

儲存：室溫可保存 2 年。

使用防護建議：miRNA Reagent A 溶液中含有胍鹽，其具有 強烈的腐蝕性，試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等 防護措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就 醫(yī)。

操作方法： 1. 組織樣本提取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物組 織則再加入 10μl β-巰基乙醇，混合均勻。 (2) 在液氮條件下充分將組織研磨粉碎，將一定的樣品量（見 樣本使用量表）研磨成粉狀的組織加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震蕩至組織粉末溶解于裂 解液中。室溫靜置 5min 以充分裂解細胞。 注意：將組織加入到 miRNA Reagent A 后要迅速將組織震散，否 則易引起組織成團狀，不容易裂解。如發(fā)生成團狀，務移液器 將團狀組織吹打松散。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 (4) 向上述溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用力震蕩數次， 室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，

2. 細胞樣本提取 (1) 貼壁細胞：消化細胞后，離心收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混 合均勻，室溫放置 5min。 (2) 懸浮細胞：直接離心后，收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混合均勻， 室溫放置 5min。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 注意：加入細胞體積數與 miRNA Reagent B 總體積數為 350μl。如加入 50μl細胞，則 miRNA Reagent B使用 300μl。 (4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用 力震蕩數次，室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，。

常見問題匯總： (1) 本方法提取的小 RNA，95％以上為小 RNA（200nt 的 RNA，通常殘留的>200nt RNA 不影響后續(xù)試驗操作。 (2) 本試劑盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的 RNA，因此更適合做后續(xù)反轉錄試驗，從而進行定量試驗。 (3) 使用本試劑盒提取的 miRNA 濃度通常在 50ng/μl 左右， 取 5～10μl 即可用于電泳檢測。取 1~2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應

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