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上海金穗生物科技有限公司
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用可溶性*化抗原進行選擇

時間:2012-12-25閱讀:203
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1.使用廠商*的試劑盒對抗原進行*化。如果用DTT洗脫,可以采用NHS—SS*。
2.用2%MPBS封閉1.5ml微量離心管,室溫1小時;然后,棄去封閉緩沖液。
3.在1個1.5ml微量離心管中,用2%MPBS封閉100ul鏈霉親和素磁珠,室溫1小時。封閉后,用磁性試管架將磁珠吸向一側(cè),收集磁珠。棄去緩沖液。
4,預(yù)先削減文庫中結(jié)合鏈霉親和素的抗體:在2%MPBS中將1012~1013個噬菌體(首輪選擇時為1013個,其后選擇為1012個)與100ul鏈霉親和素磁珠孵育1小時,反應(yīng)體積為lml。用磁性試管架將磁珠拉向一側(cè),收集噬菌體抗體并棄去磁珠。
5.在已封閉處理的試管中,加入lml預(yù)先削減的噬菌體抗體,再加入*化抗原(100~500nmol/L)。轉(zhuǎn)臺上轉(zhuǎn)動,室溫孵育1小時。
6.將已封閉的100ul鏈霉親和素磁珠加入試管,并在轉(zhuǎn)臺上室溫孵育15分鐘。將試管放在磁架30秒。磁珠將移向磁鐵。
7.抽吸試管,讓磁珠留在微量離心管側(cè)面。是用1個200ul吸頭套在巴氏滴管上,再接到真空源上進行抽吸操作。用PBS/Tween洗滌磁珠7次(每次lml),接著用MPBS洗滌2次以及用PBS洗滌1次。每隔一次洗滌后,將磁珠轉(zhuǎn)移至1個新的1.5m1試管內(nèi),將有助于有效洗滌。
8.加入lmll00mmol/L三乙基胺洗脫噬菌體,給試管加蓋;并來回轉(zhuǎn)動8分鐘。用磁架將磁珠拉向一側(cè),并將溶液轉(zhuǎn)移到1個含有500ul lmol/L Tris(pH 7.4)的Eppendorf管中。
9.繼續(xù)進行步驟7前面的流程來準備次輪選擇。根據(jù)洗脫的噬菌體滴度情況,次輪選擇所用抗原濃度可以降低為原來的1/11。

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