抗體可以含有超過50個CDR殘基。因此帶來一個問題，就是選擇哪個CDR區(qū)和哪個CDR殘基進(jìn)行突變。我們和其他小組的結(jié)果都顯示：定位于VH CDR3和VL CDR3的靶向突變是用噬菌體展示提高親和力的有效方法。例如，我們通過依序靶向突變VH和VL CDR3區(qū)域，可以將一種抗ErbB2抗體的親和力提高1200倍以上。與之類似，Yang等人突變了5個基因文庫中的4種CDR（VH CDRl、VL CDRl、VH CDR3和Vu CDR3）將突變相互獨立組合，可以使抗gpl20 Fab的親和力提高420倍。不過，他們也觀察到，優(yōu)化CDR3區(qū)可以使親和力提升的幅度達(dá)到大。因此，我們開始時也是選擇VH和VL CDR3區(qū)域進(jìn)行突變。
當(dāng)進(jìn)行CDR殘基隨機(jī)化時，能有效利用序列空間的手段是將蛋白數(shù)據(jù)文庫（PDB）中同源性高的V區(qū)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子建模；這樣可以分辨出哪些是含有溶劑可接近性側(cè)鏈的殘基，而哪些是含有隱蔽性側(cè)鏈的殘基。我們前期的試驗結(jié)果表明：對含有隱蔽性殘基的隨機(jī)化通常只會導(dǎo)致重新選擇野生型序列。我們也避免對*和*進(jìn)行突變，因為二者在選擇后會毫無例外地恢復(fù)為野生型。*常常是CDR轉(zhuǎn)角的關(guān)鍵性殘基；*則通常是基本結(jié)構(gòu)的或接觸點殘基。另外一些選擇適當(dāng)CDR殘基進(jìn)行突變的方法是基于對體內(nèi)親和力成熟中突變位點的研究基礎(chǔ)之上。再次免疫反應(yīng)時，突變會頻繁集中于CDR中的一些熱點。例如，體內(nèi)中AGY所編碼的*比TCN更易突變D6]。我們用位點導(dǎo)向突變方法進(jìn)行親和力成熟時，也觀察到類似的突變模式并建議可以針對這些熱點殘基進(jìn)行靶向突變。有篇進(jìn)行親和力成熟的報道，其中僅僅對VL CDR3中類似熱點進(jìn)行了靶向定位突變，卻成功提高了來自很小容量抗體文庫中抗體片段的親和力。
CDR的優(yōu)化可采取平行或序貫方法進(jìn)行。在CDR3平行隨機(jī)化時，將兩個CDR3分別獨立隨機(jī)化，再將單獨克隆中有利的突變合并在一起。雖然這個策略在數(shù)種抗體優(yōu)化中獲得成功，但并非所有突變都能累加。這不難理解，因為許多CDR殘基是互不兼容的。因此，我們傾向于對抗體CDR區(qū)進(jìn)行序貫靶向突變。
在我們實驗室，提高抗體親和力的靶向位點突變和鏈改組（隨機(jī)突變）兩種方法都被采用。我們還用抗ErbB2單鏈Fv（VH和VL）抗體片段（scFv）對這兩種方法進(jìn)行了比較。總體上，發(fā)現(xiàn)抗體中CDR3的靶向位點突變是利用噬菌體展示提高親和力更為有效的方法。不過，我們在下文對靶向位點突變和鏈改組兩種方法都進(jìn)行了描述。我們實驗室專門從事scFv抗體片段研究方面的工作，因此以下實驗方案都以此模式為基礎(chǔ)，盡管總體原則上這些實驗方案也可被用于抗原結(jié)合性抗體片段（Fab）的成熟。