非洲豬瘟試劑盒廠家非洲豬瘟試劑盒廠家健康豬與患病豬或污染物直接接觸是非洲豬瘟最主要的傳播途徑，豬被帶毒的蜱等媒介昆蟲叮咬也存在感染可能性。

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

 商品名稱：無

【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

【用法與判定】

1 用法

1.1待檢樣品釆集、保存及運輸

1.1.1樣品釆集

（1） 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

（2） 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

（3） 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時，-70°C條件下保存，避免反復(fù)凍 融。

1.1.3樣品運輸泡沫箱加冰袋后密封進(jìn)行運輸。包裝和運輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動 物病原微生物菌（毒）種或者樣品運輸包裝規(guī)范》和交通運輸部門關(guān)于危險品運輸管理的有關(guān)規(guī)定。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號待檢。

1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000 r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

1.2.3環(huán)境樣品處理

1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中，編號備用。

1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進(jìn)行核酸提取。

1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進(jìn)行DNA核酸提取。

1.4熒光PCR反應(yīng)：

1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設(shè)被 檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下：

試劑 體系

PCR 反應(yīng)液 17× (n+1) μL

酶混合液        3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋，混勻后瞬時離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運行以下程序：

熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環(huán)的55℃時采集熒光信號。設(shè)置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。（注：若熒光PCR儀（如AB17500）按說明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時間短無法運行，可將預(yù)擴增和PCR擴增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒）

2結(jié)果判定

2.1試驗有效性判定

陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。則判試驗結(jié)果有效。否則，此次試驗視為無效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢測結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

2.2.2可疑：樣本檢測結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，如果重復(fù)實驗 結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性，否則為陰性。

2.2.3陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

【注意事項】（1）實驗前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過 程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得好的結(jié)果。

（2） 實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴增區(qū)-分析區(qū)順序 進(jìn)行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

（3） 核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進(jìn)入 下一步實驗或凍保。

（4） 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

（5） 凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下*融化，瞬時離心使液體*沉于管底。避免反復(fù)凍融， 以免影響試劑性能。

（6） 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

（7） 擴增產(chǎn)物禁止開蓋，實驗產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集，遠(yuǎn)離PCR實驗室進(jìn)行無害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒

【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個月。

【批準(zhǔn)文號】獸藥生字163668871

【生產(chǎn)企業(yè)】鄭州中道生物技術(shù)有限公司

僅供獸醫(yī)診斷使用