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標準的PCR三個基本反應步驟

時間:2022/7/18閱讀:2718
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類    似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復性)--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成:

1、模板DNA的變性(90℃-95℃):

模板DNA經(jīng)加熱至90~95℃一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應作準備,雙鏈DNA在高溫作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。

2、模板DNA與引物的退火(復性)(60℃-65℃):

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至50~60℃,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。

3、引物的延伸(70℃-75℃):

DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR全稱為聚合酶鏈式反應,是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù)。在Taq酶的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開始以從5′到3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。




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