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摘要經(jīng)過測試,isoSTAR相較于DDA及DDA+SESTAR具有更低的檢測限及對靶標(biāo)肽段更好的檢測效果。隨后作者結(jié)合了isoSTAR與開放式搜索技術(shù)開發(fā)了代謝過程引發(fā)新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)流程。

  【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日,北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北大成都前沿交叉生物技術(shù)研究院王初課題組在Journal of the American Chemical Society雜志上發(fā)表了題為“Discovery of Cysteine Carboxyalkylations by Real-time Isotopic Signature Targeted Profiling”的文章。在這項工作中,作者開發(fā)了名為isoSTAR(isotopic signature targeted profiling)的基于特殊同位素信號的質(zhì)譜靶向檢測新方法,并利用此方法發(fā)現(xiàn)了脂肪酸代謝過程中產(chǎn)生的一系列新型半胱氨酸羧甲基化修飾(Cysteine Carboxyalkylations)。
 
  基于特殊同位素信號開發(fā)靶向質(zhì)譜檢測技術(shù),發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝中產(chǎn)生的新型半胱氨酸羧甲基化修飾
 
  數(shù)據(jù)依賴性采集(Data-Dependent Acquisition,DDA)是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的檢測方法之一,然而由于質(zhì)譜掃描速度的限制,其僅會按強度由高到低順序選擇部分肽段離子進行碎裂及二級譜掃描,導(dǎo)致強度較低的肽段離子很難被檢測到。王初課題組此前曾開發(fā)了基于硒同位素的靶向組學(xué)分析方法SESTAR(doi: 10.1021/acscentsci.8b00112)和SESTAR++(doi: 10.1016/bs.mie.2021.10.013),可以在質(zhì)譜一級譜數(shù)據(jù)中選擇性識別出可能含硒肽段的同位素信號,從而提升含硒肽段的鑒定效果。然而此方法需要兩輪質(zhì)譜檢測才能完成,會造成檢測時間及樣品的浪費,并且因兩次檢測間的不平行造成通量減少甚至靶標(biāo)丟失。在該工作中,作者利用儀器公司提供的質(zhì)譜控制接口IAPI,在SESTAR基礎(chǔ)上開發(fā)出了名為isoSTAR的質(zhì)譜檢測流程。isoSTAR利用快速同位素特征識別算法對靶標(biāo)肽段特殊同位素信號進行實時識別,并立即向質(zhì)譜發(fā)出靶向掃描請求,從而可以一步直接對低豐度靶標(biāo)肽段進行深度的靶向檢測。
 
  經(jīng)過測試,isoSTAR相較于DDA及DDA+SESTAR具有更低的檢測限及對靶標(biāo)肽段更好的檢測效果。隨后作者結(jié)合了isoSTAR與開放式搜索技術(shù)開發(fā)了代謝過程引發(fā)新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)流程;诖x過程中有許多翻譯后修飾相關(guān)的前體及活性中間體,此流程中利用了內(nèi)源代謝物的生物正交類似物探針進行代謝標(biāo)記,隨后利用帶有輕、重甘氨酸1:1混合的脫硫生物素富集標(biāo)簽“GG tag”進行特殊同位素信號的引入及富集,再使用isoSTAR對富集的修飾肽段進行靶向檢測。在通過開放式搜索技術(shù)分析出肽段信息及PTM的質(zhì)量偏移后,最終利用一級譜及二級譜上的特征同位素信號篩選出可信的翻譯后修飾進入后續(xù)驗證流程。
 
  長鏈脂肪酸及短鏈脂肪酸相關(guān)的翻譯后修飾有較多報道(例如棕櫚酰化及巴豆;),而中鏈脂肪酸相關(guān)的翻譯后修飾則鮮有報道。作者利用中鏈脂肪酸類似物辛炔酸對細(xì)胞進行了代謝標(biāo)記,并利用“GG tag”進行特殊同位素信號的引入及富集,再利用isoSTAR進行質(zhì)譜檢測。進行開放式數(shù)據(jù)搜索后,作者發(fā)現(xiàn)了在半胱氨酸上的兩種新型PTM,經(jīng)過驗證這些PTM是β-氧化過程中間產(chǎn)物α, β-不飽和脂肪酸與半胱氨酸巰基發(fā)生邁克爾加成的產(chǎn)物,作者將此修飾命名為半胱氨酸羧甲基化修飾。在更接近生理環(huán)境的條件下,作者也成功發(fā)現(xiàn)了脂肪酸β-氧化代謝中間產(chǎn)物對半胱氨酸修飾造成的一系列羧甲基化修飾,證明了新型半胱氨酸羧甲基化修飾在生理或病理環(huán)境下的存在。
 
  王初為該論文的通訊作者,北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生賈國賡、劉亦成及馮天宇為本文的共同第一作者。張子璇、唐歡、楊帆、高晉君等為此工作的完成作出了重要貢獻。該工作得到了科技部重點研發(fā)項目、國家自然科學(xué)基金、北京分子科學(xué)國家研究中心、北京大學(xué)AI4S專項等項目的支持。

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