【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】面向原位結(jié)構(gòu)解析的冷凍電子斷層成像(cryo-ET)是研究生物大分子復(fù)合物的原位高分辨率結(jié)構(gòu)及其相互作用關(guān)系的關(guān)鍵技術(shù)。但受限于電子束穿透能力，需要先利用聚焦離子束(cryo-FIB)將細(xì)胞和組織樣品減薄成200納米左右的薄片后才能進(jìn)行cryo-ET數(shù)據(jù)采集。冷凍光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)可以為cryo-FIB精準(zhǔn)制備包含特定目標(biāo)結(jié)構(gòu)的冷凍含水切片提供熒光定位指導(dǎo)，但是冷凍熒光顯微鏡的光學(xué)分辨能力以及光鏡、電鏡圖像的對(duì)齊精度是制約冷凍光電關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)成功率的關(guān)鍵因素。
 

　　為了解決上述技術(shù)瓶頸，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺(tái)生物成像中心一直致力于開(kāi)發(fā)新型冷凍光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)，在前期自主研發(fā)的冷凍光電關(guān)聯(lián)成像高真空光學(xué)冷臺(tái)HOPE(Journal of Structural Biology，2017)基礎(chǔ)上，通過(guò)引入結(jié)構(gòu)光照明成像技術(shù)，成功研制了冷凍結(jié)構(gòu)光照明成像系統(tǒng)HOPE-SIM，實(shí)現(xiàn)了橫向優(yōu)于200納米的光學(xué)分辨率，以及優(yōu)于150納米的光鏡-聚焦離子束三維關(guān)聯(lián)對(duì)齊精度，相關(guān)研究成果于4月29日在線發(fā)表在《通訊-生物》(Communications Biology)上。
 

　　光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像技術(shù)(Correlative Light and Electron Microscopy，CLEM)，是利用熒光特異標(biāo)記對(duì)特定生物大分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行熒光示蹤，實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)細(xì)胞的三維熒光定位成像，之后通過(guò)熒光圖像和電鏡圖像的配準(zhǔn)，獲得熒光標(biāo)記信號(hào)和電鏡超微結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)信息。冷凍光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)的應(yīng)用方向之一，是通過(guò)關(guān)聯(lián)圖像，指示出熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在電鏡圖像中的具體位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光示蹤目標(biāo)物的電鏡高分辨率結(jié)構(gòu)解析。而得益于光鏡成像對(duì)生物樣品的無(wú)損特性，可以在不損傷樣品的前提下獲得樣品內(nèi)部的三維熒光定位信息，再通過(guò)光電關(guān)聯(lián)成像流程和關(guān)聯(lián)對(duì)齊軟件，將三維熒光圖像與掃描電鏡圖像關(guān)聯(lián)匹配，實(shí)現(xiàn)在熒光信號(hào)的指導(dǎo)下進(jìn)行cryo-FIB對(duì)目標(biāo)區(qū)域的減薄加工。如此，便可以避免“盲切”，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光指示目標(biāo)物的指導(dǎo)切割，以期提高冷凍聚焦離子束技術(shù)用于電子斷層成像切片樣品制備的效率。
 

　　目前，光電關(guān)聯(lián)成像指導(dǎo)cryo-FIB減薄技術(shù)流程的實(shí)現(xiàn)方式有多種類(lèi)型，根據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成可以分為光鏡電鏡分體式光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)和集成型光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)。生物成像中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)自2013年開(kāi)始專注于冷凍光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)方法學(xué)研究，在光鏡電鏡分體式光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)研制方面， 于2017年自主研制了一款可搭載在倒置熒光顯微鏡上的高真空光學(xué)冷臺(tái)HOPE(High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM)，HOPE可與透射電鏡冷凍樣品桿適配連接，完成熒光定位后樣品將隨冷凍樣品桿被轉(zhuǎn)移進(jìn)電鏡當(dāng)中進(jìn)行高分辨率數(shù)據(jù)采集，同時(shí)結(jié)合光電關(guān)聯(lián)定位軟件，可以實(shí)現(xiàn)大視野光學(xué)定位成像與電鏡成像的匹配。HOPE采用冷凍樣品桿來(lái)實(shí)現(xiàn)冷凍光鏡成像、冷凍傳輸以及冷凍透射電鏡成像，有效避免了光電關(guān)聯(lián)成像過(guò)程中對(duì)冷凍載網(wǎng)的反復(fù)夾取，保證了冷凍樣品的完整性和同一性，有效提高了關(guān)聯(lián)成功率和實(shí)驗(yàn)效率。
 

　　然而，基于寬場(chǎng)成像技術(shù)的HOPE系統(tǒng)受限于光學(xué)衍射極限和冷凍光學(xué)成像裝置的空間限制等，僅能使用長(zhǎng)工作距離、低數(shù)值孔徑的冷凍熒光成像系統(tǒng)，所能達(dá)到的橫向分辨率約為400-500納米，縱向分辨率則達(dá)微米級(jí)，這對(duì)于精準(zhǔn)捕獲數(shù)微米厚度細(xì)胞內(nèi)百納米尺度的目標(biāo)結(jié)構(gòu)而言，是非常不利的。
 

　　結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光成像技術(shù)在能提高寬場(chǎng)熒光顯微鏡一倍分辨率的前提下，還具備不需要特殊的熒光探針、成像速度快、輻照密度低等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，是所有超分辨成像技術(shù)中最適合應(yīng)用到冷凍環(huán)境中對(duì)冷凍樣品進(jìn)行高分辨率成像的技術(shù)。因此，研究團(tuán)隊(duì)選擇了結(jié)構(gòu)光照明成像技術(shù)作為提高冷凍熒光成像分辨率的手段，基于倒置熒光顯微鏡自主研制了大腔室高真空冷臺(tái)，腔室內(nèi)置0.9NA長(zhǎng)工作距離光學(xué)物鏡和防污染器系統(tǒng)(ACS和cryo-box)、外接真空傳輸系統(tǒng)(TPS)以及冷凍電鏡樣品桿(cryo-holder)適配器。同時(shí)，借助三維結(jié)構(gòu)光照明(SIM)光路，實(shí)現(xiàn)了真空環(huán)境下對(duì)冷凍樣品的三維結(jié)構(gòu)光照明成像，在提高冷凍光鏡分辨率的同時(shí)，有效增強(qiáng)了光電關(guān)聯(lián)成像樣品傳輸過(guò)程中對(duì)冷凍樣品的保護(hù)。
 

　　圖1 冷凍結(jié)構(gòu)光照明成像系統(tǒng)HOPE-SIM。a.HOPE-SIM硬件組成，b. HOPE-SIM設(shè)計(jì)原理圖，c. HOPE-SIM光路原理圖
 

　　借助HOPE-SIM高分辨率冷凍光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)以及自主編寫(xiě)的三維關(guān)聯(lián)對(duì)齊軟件3D-View，團(tuán)隊(duì)成功制備了包含宿主細(xì)胞內(nèi)鼠皰疹病毒(圖2)和海拉細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的中心體(圖3)的細(xì)胞切片樣品，通過(guò)冷凍電子斷層原位結(jié)構(gòu)分析圖像處理流程和軟件分析其在原位結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于HOPE-SIM技術(shù)的高精度冷凍光電方法可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)于150nm的三維對(duì)齊精度，為尺寸較大、胞內(nèi)豐度高的目標(biāo)物的原位捕獲提供了一種高效、精確的靶向冷凍聚焦離子束減薄技術(shù)方案。
 

　　圖2 基于 HOPE-SIM冷凍光電聯(lián)技術(shù)捕獲宿主細(xì)胞中的MHV-68病毒顆粒。a.冷凍明場(chǎng)透射光圖像；b.HOPE-SIM熒光圖像的z投影。綠色，熒光微球。紅色，MHV-68病毒；c將b中的熒光圖像與a中的明場(chǎng)圖像合并，以顯示目標(biāo)信號(hào)的位置；d.冷凍SIM和冷凍FIB圖像之間的三維關(guān)聯(lián)匹配；e.對(duì)目標(biāo)區(qū)域減薄后的冷凍FIB圖像；f.減薄后冷凍掃描電鏡圖像，與b中冷凍SIM圖像的融合；g.制備的冷凍含水切片的冷凍透射電鏡顯微照片(3600倍)；h.冷凍斷層掃描成像，放大倍率為64000倍，顯示了被捕獲的病毒顆粒。
 

　　圖3 基于HOPE-SIM技術(shù)流程精準(zhǔn)捕獲海拉細(xì)胞內(nèi)紅色熒光標(biāo)記的中心體。a.3D-View光-電關(guān)聯(lián)軟件獲得的冷凍結(jié)構(gòu)光-cryo-FIB關(guān)聯(lián)配準(zhǔn)圖；b.cryo-FIB對(duì)紅色熒光標(biāo)記所在區(qū)域進(jìn)行減??；c.cryo-FIB減薄獲得的200nm冷凍含水切片；d.冷凍含水切片在透射電鏡下8700倍成像，黃色框線內(nèi)為目標(biāo)中心體；e.目標(biāo)中心體的cryo-ET數(shù)據(jù)采集(53000倍)激光指向位置主動(dòng)穩(wěn)定系統(tǒng)示意圖。
 

　　相關(guān)研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(B類(lèi))等項(xiàng)目的資助。
 

　　值得一提的是，在集成型光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)研制方面， 2023年1月，《自然-方法》(Nature Methods)報(bào)道了中科院院士、生物物理所研究員徐濤和研究員紀(jì)偉團(tuán)隊(duì)研發(fā)的cryo-CLIEM系統(tǒng)和生物成像中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的三束共焦成像系統(tǒng)ELI-TriScope系統(tǒng)，在雙束掃描電鏡真空腔室內(nèi)集成了光學(xué)成像系統(tǒng)，避免了樣品傳輸過(guò)程，有效提高了冷凍光電關(guān)聯(lián)成像的精度和成功率。其中生物成像中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)ELI-TriScope系統(tǒng)集成了一個(gè)基于冷凍樣品桿的傳輸系統(tǒng)(cryo-transfer system)，并在冷凍樣品下方嵌入了一個(gè)倒置熒光成像系統(tǒng)(cryo-STAR system)，從而實(shí)現(xiàn)電子束(E)、光束(L)和離子束(I)被精確地聚焦到同一點(diǎn)上，可以在cryo-FIB減薄的同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)控目標(biāo)分子的熒光信號(hào)，顯著提高了cryo-FIB減薄技術(shù)對(duì)特定目標(biāo)物的捕獲精度，將制備冷凍含水切片的時(shí)間成本從每片2-2.5小時(shí)降低到約0.8小時(shí)。
 

　　生物成像中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的基于結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)的HOPE-SIM系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)三維高分辨率冷凍熒光成像，同時(shí)還可以通過(guò)冷凍樣品桿直接銜接三束共焦光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)ELI-TriScope，實(shí)現(xiàn)高分辨三維冷凍熒光成像的同時(shí)，完成后續(xù)原位熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控聚焦離子束減薄全技術(shù)流程，有效提高了冷凍聚焦離子束減薄的效率、準(zhǔn)確性、成功率和樣品制備通量，為原位結(jié)構(gòu)解析研究提供了成功的解決方案，在未來(lái)的原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)中有巨大應(yīng)用潛力。