【儀表網(wǎng) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)】近日，國家標(biāo)準(zhǔn)計劃《大規(guī)模并行測序 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估》編制完成并征求意見，時間截止到2023年6月23日。主要起草單位為中國測試技術(shù)研究院等。
 

　　測序技術(shù)應(yīng)用廣泛，一次測序得到大量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)整理與分析是高通量測序應(yīng)用于生物研究最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，若未按需求對數(shù)據(jù)進行分析與評估，則所測得數(shù)據(jù)無法驗證實驗結(jié)果。有效的數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制有利于物種鑒定、病原體識別、病毒基因溯源、醫(yī)療診斷、環(huán)境微生物檢測、測序儀校準(zhǔn)等需要，用于通過測序和序列比對分析來進行基因鑒定的行業(yè)/科研領(lǐng)域。
 

　　大規(guī)模并行測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量評估是一項跨領(lǐng)域的分析手段，涉及生物信息學(xué)知識較多，廣泛影響生物科技的許多方面。例如，在食品領(lǐng)域，即使沒有參考樣本或參考基因序列，通過對植物或動物產(chǎn)品中源性成分各目標(biāo)基因進行測序，通過數(shù)據(jù)庫序列信息比對即可確定源性，以進行物種真實性鑒定，實現(xiàn)對復(fù)雜背景樣本和未知物種樣本中各種源性成分信息的高通量檢測，用于品牌維護及肉類摻假鑒定;對土壤、水體、空氣中微生物及發(fā)酵產(chǎn)品、果蔬貯藏過程中微生物的多樣性及功能分析;通過血清中腫瘤標(biāo)志物的測定，協(xié)助腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及療效評價;通過檢測腫瘤患者特定的基因變異情況，協(xié)助實施針對靶點的精準(zhǔn)治療方案;基于reads 深度、雙末端映射、拆分read、從頭拼接等方法檢測拷貝數(shù)變異，以探究人類多種疾病的成因。
 

　　大規(guī)模并行測序技術(shù)由于其準(zhǔn)確性和檢測通量改變了整個檢測領(lǐng)域的發(fā)展。一次高通量測序可以讀取400 000-4 000 000條序列，不同的測序平臺可讀取到的堿基數(shù)不等，測序平臺的不斷進步與更新促進了測序方法/儀器的廣泛發(fā)展，目前NGS 的主要代表平臺有Illumina公司的Solexa基因組分析儀、華大基因的MGISEQ-2000平臺及ABI的SOLiD測序儀，Solexa 聚合酶合成測序的關(guān)鍵技術(shù)是:“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，SOLiD連接酶測序取代了傳統(tǒng)PCR，可對單拷貝DNA片段進行大規(guī)模擴增和高通量測序。
 

　　然而，對測序所得的數(shù)據(jù)進行整理與分析仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。首先，一次測序得到海量數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)分析處理需采用大量軟件及工具，要求試驗人員熟練操作各項軟件并具有生物信息學(xué)知識的儲備;其次，測序過程中存在儀器報錯的可能性，影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，加大數(shù)據(jù)分析難度;此外，核酸濃度及純度未達到測序要求、選擇不合適的文庫制備方法會影響測序結(jié)果，導(dǎo)致檢測效率低、準(zhǔn)確性差。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)的研制有利于提高測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可信度、支持測序方法的選擇和優(yōu)化、提供可用于性能資質(zhì)鑒定的關(guān)鍵性能參數(shù)。具有更高可信度的生物技術(shù)和生物學(xué)工業(yè)數(shù)據(jù)，能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，提升檢測準(zhǔn)確性，減少風(fēng)險和成本，促進國際交流。
 

　　本文件適用于測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估與驗證。確定了原始數(shù)據(jù)的評估指標(biāo)(序列長度分布、每個序列GC含量、質(zhì)量值、序列重復(fù)水平、超出閾值水平、集群密度、出錯率等)、分析用于不同應(yīng)用的序列校正及比對軟件;測序校正和比對的質(zhì)量控制，包括單端測序片段比對，配對段測序片段比對，子片段的長度比對;變異識別，能識別SNV、插入缺失、CNV和SVs 四種變異類型，變異識別質(zhì)量指標(biāo)包括變異質(zhì)量值、等位基因讀取百分比、樣品間污染分析等;質(zhì)量指標(biāo)驗證，包括建立去除低質(zhì)量堿基的方法、確定比對質(zhì)量參數(shù)、定義平均覆蓋范圍;高通量測序方法特異性及靈敏度確認(單一物種驗證、混合樣品檢測、不同加工方式樣品檢測)。