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商品屬性：
產(chǎn)品名稱 | |
規(guī)格 | 50管/48樣 |
檢測方法 | 紫外分光光度法 |
貨號 | GOY-01S6926 |
商品介紹：
測定意義
CAD是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最后一步，催化多種不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
測定原理：
CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH，在340nm下測定NADPH生成速率，即可反映CAD活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
實(shí)驗(yàn)方法學(xué)：
一、肝素的配制： 市售肝素凍干粉140單位/mg，1克瓶裝，每瓶140，000單位，稱取0.1克肝素凍干粉，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml。取50～100μl濕潤管壁，可抗凝人血3～5ml，血液不會凝固。老鼠血易凝固，所以最好更濃一些?？梢匀?/span>0.1克肝素凍干粉，加3ml生理鹽水溶解后，取50～100μl,可抗凝鼠血2～4ml。 肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉，加2.5ml生理鹽水。取100μl～150μl滴入塑料或玻璃管中，濕潤管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉(zhuǎn)動，每隔5～10分鐘轉(zhuǎn)動一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2～5ml血液不凝固。 | 二、血液樣本的收集： 全血根據(jù)收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。 1、不抗凝收集血清:將收集好的全血,靜置1～2小時，直接低速離心分離出血清待用或保存。 2、抗凝收集血漿: 收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接低速離心分離血漿(也可靜置半小時左右再低速離心分離血漿)待用或保存。根據(jù)不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實(shí)驗(yàn)室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA。 |
選擇抗凝的注意點(diǎn)：
①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時所取的全血的量也要盡量一致;
②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導(dǎo)致凝固;
③、抗凝全血收集的血漿相對較多（1ml抗凝全血能分離出0.4～0.5ml血漿）;
④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時可能會出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后
用于測定。
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操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
