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組織均質(zhì)勻漿及蛋白提取

來(lái)源：北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司 2013年06月14日 21:25

整個(gè)組織（或者一部分組織，比如1克，具體需要考慮組織的大小和所含藥物量及方法的檢測(cè)限），置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校ū热缭嚬埽?ml 15ml），加入適當(dāng)體積的適當(dāng)溶劑（體積可采用1:2，即1g組織用2ml溶劑，至于溶劑的種類，可選擇水、甲醇、乙腈等，具體需要考慮藥物的溶解性），然后以 18000rpm的OmniPrep多樣品剪切勻漿機(jī) 或 6m/s Omni Bead Ruptor 24多樣品研磨珠進(jìn)行勻漿（時(shí)間大約1min），直至獲得均一的勻漿液，然后超聲5min（為充分溶出藥物，但須考慮藥物的穩(wěn)定性）、3500g離心5min，分取上清液。然后按照與血漿的預(yù)處理方法繼續(xù)處理進(jìn)樣測(cè)定即可。

上述操作的主要目的是將組織細(xì)胞中的藥物*溶解出來(lái)，從而能夠測(cè)定全部的藥物濃度。因此如果采用細(xì)胞破碎儀OMNI Sonic Ruptor 400和Sonic Ruptor 4000也可以。

但在操作中需要考慮藥物的穩(wěn)定性。畢竟高速勻漿會(huì)產(chǎn)熱導(dǎo)致藥物降解。

勻漿時(shí)保持低溫，因?yàn)?0度左右代謝酶會(huì)產(chǎn)生活性，可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

勻漿的目的是什么？應(yīng)該是測(cè)里面的某種成分的含量或活性吧，或者其他目的。冰水浴的目的是什么？防止活性成分分解或滅活。如果你要測(cè)的東西穩(wěn)定性做夠好，沒(méi)必要冰水浴

組織勻漿的時(shí)候需要在冰上操作,加蛋白酶抑制劑

盡量在冰上,溫度當(dāng)然是低些,以防蛋白降解還怕尿素分解,以致于氨甲基化修飾蛋白,影響后面的質(zhì)譜鑒定

控制在低溫不要連續(xù)勻漿可以每勻漿10秒就把勻漿的容器放置于冰水混合物中降溫，然后再勻漿，這樣可以減少對(duì)目的物的損傷

操作步驟：參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》
1、用*或*迅速將清洗的組織分離成適宜的小塊，如1cm^3
2、每體積濕重組織通常加3~5倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液至勻漿容器內(nèi)
3、制備勻漿：1）手動(dòng)的玻璃勻漿器勻漿10－20次。2）剪切式組織勻漿均質(zhì)以10000－28000rpm的速度，高速勻漿3次，每次10秒，次間暫停幾秒。3） 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀以線速度6.5m/s，高速勻漿3次，每次15秒，次間間隔10秒。
4、離心去上清，轉(zhuǎn)速可參照 3,000. rpm/15 minutes/4'C

5組織勻漿經(jīng)提取液提取后得到的應(yīng)是組織細(xì)胞的總蛋白質(zhì)

注意事項(xiàng)：

避免血液影響：1 充分放血（找到頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈，剪斷，放血會(huì)比較充分）。
2 對(duì)于血流較豐富的器官，比如肝臟，可用生理鹽水從肝門(mén)靜脈灌流沖洗。
3勻漿過(guò)程應(yīng)注意維持低溫，可外置冰水浴 Omni公司兩款設(shè)備可選配冰槽和Cryo 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀冷卻單元

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