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本實(shí)驗(yàn)方案采用Thermo Scientific的Multiskan FC型酶標(biāo)儀和Wellwash 型洗板機(jī)(由北京平利洋公司提供),結(jié)合Abraxis三聚氰胺檢測(cè)試劑盒,以競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原的原理對(duì)液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)分析。
一、樣品準(zhǔn)備
巴氏消毒全脂奶(液體):
1)用稀釋液以1:10的比例稀釋牛奶樣品,如在900 μl的稀釋液中加入100 μl牛奶。
嬰幼兒配方奶粉:
1)按照配方奶粉的說(shuō)明,以稀釋液溶解奶粉,如用60 ml稀釋液溶解8.6克奶粉。
2)用稀釋液以1:5的比例稀釋奶粉溶液
二、樣品檢測(cè)
1)試劑使用前,應(yīng)使其溫度恢復(fù)至室溫(25±2℃)
2)吸取100 μl標(biāo)準(zhǔn)品(0, 20, 50, 100, 200和500 ppb)和準(zhǔn)備好的樣品加入相應(yīng)的微孔中。然后,每孔再加入50 μl的三聚氰胺HRP酶標(biāo)記物。
3)利用MK3酶標(biāo)儀的振蕩功能,振板60秒,并在室溫下孵育30分鐘。
4)孵育完后,將微孔板轉(zhuǎn)移到Wellwash 4MK2洗板機(jī)上進(jìn)行洗板,每孔加250 μl洗液,洗板四次。
5)每孔加入100 μl顯色底物溶液,避光孵育20分鐘。
6)每孔加入100 μl終止液,終止顯色反應(yīng)。
7)在MK3酶標(biāo)儀上讀板,測(cè)量波長(zhǎng)450nm。
三、結(jié)果分析
1)以濃度為0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為基準(zhǔn)(B0),歸一化標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)吸光值B/B0(B指除B0以外的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值)。
2)繪制以標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0為Y軸坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸坐標(biāo)的散點(diǎn)圖。
3)對(duì)該散點(diǎn)圖進(jìn)行直線擬合。以該擬合曲線的直線方程對(duì)待測(cè)樣品濃度進(jìn)行計(jì)算。
4)如果樣品吸光值大于zui小標(biāo)樣的吸光值,則該樣品的濃度<20 ppb;如果樣品吸光值小于zui大標(biāo)樣的吸光值,則樣品的濃度>500 ppb。
5)結(jié)合稀釋倍數(shù),計(jì)算zui終液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺濃度,如液態(tài)奶稀釋倍數(shù)是10倍。
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