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質(zhì)量過載

質(zhì)量過載又稱為濃度過載，就是指在小體積進樣時（體積未過載），由于進樣濃度較高，靠近譜峰峰帶的固定相被飽和，也就是說，進樣某一組分超過了色譜柱的載樣量而出現(xiàn)過載的現(xiàn)象。一般表現(xiàn)為色譜峰峰形拖尾，柱效較低。

在小體積進樣時，如果質(zhì)量未超載，隨著樣品量的增加（a

隨著樣品量繼續(xù)增加，進到色譜柱中的樣品達到飽和，譜峰就變形了。

可以看出，隨著進樣質(zhì)量不斷增加，譜峰峰寬不斷增加，最終變成了直角三角形的形狀，同時譜峰的理論塔板數(shù)也不斷降低。通常，對于內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，其載樣量<50μg。如果是做方法轉(zhuǎn)移到其他色譜柱上，則需要調(diào)整進樣量，防止出現(xiàn)過載。

載樣量主要與色譜柱固定相和待分析物的性質(zhì)有關。首先固定相類型不一樣，品牌不一樣會造成載樣量較大的差異。其次待分析物質(zhì)性質(zhì)也會直接影響到色譜柱載樣量。例如離子態(tài)的堿性化合物就很容易過載，不僅無法達到<50μg的量級，有時候甚至1μg的量就能造成過載的現(xiàn)象。因此在常規(guī)疏水反相中，分子態(tài)的堿性化合物比離子態(tài)的堿性化合物有著更高的載樣量。目前的推測原因是，離子態(tài)間互相排斥作用使得待分析組分在固定相表面更易達到飽和而造成過載。同時離子態(tài)的帶正電的堿性化合物也更容易和固定相中未鍵合的活性硅羥基發(fā)生次級相互作用。針對質(zhì)量超載的問題，最簡單的方法則是減少進樣量。

另外，混合樣品進樣中過載還會導致峰保留時間的變化。

例如圖中，A’，B’為AB組分單獨進樣時的保留分離情況。A，B為混合進樣時的保留分離情況。過載的B不管是單獨進樣還是混合進樣，均保持穩(wěn)定，而A由于過量B的存在，在混合進樣時，保留時間提前。

雖然每個成分的過載是相對獨立的，但是在混合樣品進樣過程中會引起的分離度問題。這是由于環(huán)境對組分的影響。其中某一組分過載很可能造成混合進樣時保留時間相對于單獨進樣時有所改變。

體積過載

進樣體積太大通常會導致較寬的平頭峰。

從圖中可以看出，隨著進樣體積的增大，峰寬逐漸變寬，峰分離度降低。

另外體積過載還會影響峰保留時間，體積過載對保留時間短的組分影響更大，而對于較后面流出的峰影響較小。

圖中虛線為正常體積進樣，實線色譜圖為體積過載后的色譜圖。

那么，如何選擇合適的進樣體積呢？

對于在流速下 ，允許樣品進樣的體積為：

常用的各規(guī)格色譜柱：

盡管上表中各個數(shù)據(jù)是嚴格按照公式計算出來的，但是這個數(shù)據(jù)并不。色譜是經(jīng)驗科學，較之其他學科需要更多的實踐。當然，理論也為我們指引了方向，讓我們能少走彎路。

影響過載的因素及解決辦法

1、柱容量

柱容量越大越不容易過載。決定柱容量的指標是柱截面上固定相的面積占比，它與空容、填料的比表面積、表面健合率等色譜參數(shù)有關。

 需要注意的是，增加柱長并不能增加柱容量，因為樣品進樣后不可能立即分布于整個色譜柱，同樣因為無限直徑效應的緣故，增大柱內(nèi)徑也不能增大柱容量。

2、進樣量

顯然，減小進樣量可以緩解過載，有時還能夠達到分離雜質(zhì)的效果。進樣量減小一半，主成分前相鄰雜質(zhì)峰從主成分峰中分離出來，但方法對雜質(zhì)的檢出能力也隨著降低。

3、組分分配到固定相中的量

柱容量一定時，分配到固定相中的量越少，保留越小，柱越不容易過載。理論上，在固定相中不分配時，組分不保留，再大的進樣量也不會出現(xiàn)過載。對于C18/C8健合固定相，可以通過增加有機相比例減小組分在固定相中的分配來緩解過載，當然，隨著有機相的改變，方法選擇性也會發(fā)生變化。

4、組分的存在方式

對于易解離組分如酸堿性物質(zhì)，在流動相緩沖容量足夠的情況下，譜帶上任一點解離型（離子）和非解離型（分子）的比例始終一致，離子型和分子型相伴以恒定的比例流出色譜柱，出現(xiàn)的色譜峰是離子型和分子型的疊加。

如果其中一個組分過載，表現(xiàn)出一個拖尾的色譜峰，另一組分雖未過載，但由于上述原因，也會表現(xiàn)為和過載組分形狀一致大小不同的過載峰。因此易解離組分的峰型由過載的那一種存在方式?jīng)Q定。

 一般離子型比分子型組分更容易過載，故易解離組分的過載由離子型的過載決定，過載程度與其占比有關。一般通過調(diào)整流動相pH抑制組分解離可大大減小離子型比例，緩解甚至消除過載。

 對于強酸/堿性物質(zhì)，難以通過調(diào)節(jié)pH抑制解組分的解離，這個時候可以通過形成離子對復合物來減小離子型占比以緩解過載。同樣地，過載由離子型決定，形成的離子對復合物越多，離子型就越少，過載就越能得到緩解。

 更復雜的情況是既抑制解離又存在離子對試劑的時候，這個時候可以通過上述兩方面來改變離子型的占比，既可以緩解過載拖尾，又可以調(diào)整保留。情況雖然復雜，但手段卻更加靈活多樣。

5、鹽的濃度

對于離子型組分在C18/C8固定相上易于過載的原因，主要是因為離子型組分一旦進入固定相以后，離子間的排斥作用會阻止組分的進一步進入。

 我們通常使用緩沖鹽主要是為了維持流動相有足夠的緩沖容量，但另一方面緩沖鹽甚至是中性鹽的加入還可以增加流動相離子強度，部分屏蔽組分離子間的相互排斥作用，減輕過載。同時鹽還可以與離子組分形成離子對復合物，降低組分離子型比例來緩解過載。鹽濃度越大，效果越明顯。

 緩沖鹽與離子型組分形成離子對復合物所占比例到底有多少一直是筆者想知道的一個問題。其比例可以通過下式進行計算：

k’=x離子型﹒k’離子型+x離子對型﹒k’離子對型

x為各存在方式的占比，k’為相應的容量因子。

 離子對復合物的保留應與分子型的保留相當，考慮到組分堿性較強，要測定組分分子型的保留值，需要抑制組分解離，流動相pH需要高達12以上，這在普通的C18柱上難以實現(xiàn)，故以伯氨基被酰胺取代的化合物代替該物質(zhì)的分子型，并以此測得的保留值作為離子對復合物的保留值來及計算k’離子對型。 

k’離子型用緩沖液鹽濃度時（5mmol/L）的k’代替。

各緩沖液濃度下組分色譜峰均存在不同程度過載拖尾，故保留時間以色譜峰結(jié)束時的時間估算，應不至于產(chǎn)生太大誤差（其實應于各條件下取低濃度組分進樣，色譜峰不至于過載，能獲得組分的準確保留值）。

6、梯度洗脫

在梯度洗脫過程中，一方面隨著流動相有機相比例逐漸增加，組分在固定相中的分配也逐漸降低，過載的累積也就逐漸減輕。另一方面，對于低有機相比例洗脫時組分已經(jīng)形成過載峰這一既定事實，梯度洗脫的所謂“譜帶壓縮機制”也可以進行部分“逆轉(zhuǎn)”。

對于過載的譜帶，組分濃度沿著柱入口到柱出口方向逐漸增加，而高有機相比例的流動相總是首先到達靠近柱入口的低濃度組分譜帶區(qū)域，使它們不停追趕靠近柱出口的高濃度組分，最終使譜帶壓縮，以前過載拖尾的峰型得到緩解。