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引言 微量分光光度計(jì)的出現(xiàn)解決了微量樣品采用分 光法定性及定量測(cè)試的問(wèn)題?；诖颂攸c(diǎn)，該類(lèi)儀 器被廣泛用于生物、醫(yī)學(xué)等檢測(cè)樣本量并且價(jià) 格昂貴的領(lǐng)域。微量分光光度計(jì)屬于分光光度計(jì)類(lèi) 測(cè)試儀器，遵循朗伯比爾定律，但較普通的分光光 度計(jì)還是有很大的改進(jìn)。隨著儀器使用量的增多， 不得不考慮該類(lèi)儀器的溯源性問(wèn)題。2015 年相關(guān)部 門(mén)提出并計(jì)劃編制該類(lèi)儀器的校準(zhǔn)規(guī)范，但至今還 未出版正式的國(guó)家校準(zhǔn)規(guī)范。本文針對(duì)微量分光光 度計(jì)的測(cè)試原理和功能特點(diǎn)，分別對(duì)兩種校準(zhǔn)方式 進(jìn)行了探討，并提出了建議。

 1 微量分光光度計(jì)的測(cè)試原理及功能特點(diǎn) 微量分光光度計(jì)的之處在于它對(duì)測(cè)試樣品量 的要求非常低，現(xiàn)有的儀器中可測(cè)量低為 0.3 μL 的 樣品，可以節(jié)省非常且昂貴的樣品量。檢測(cè)波 長(zhǎng)范圍 200 ～ 1 000 nm，多數(shù)儀器設(shè)定了定點(diǎn)測(cè)試 波 長(zhǎng) 230 nm、260 nm 和 280 nm， 便 于 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的測(cè)試。采用發(fā)光穩(wěn)定且不需預(yù)熱的氙燈 代替鎢燈和氘燈作為光源，壽命更長(zhǎng)，光強(qiáng)更大。 該類(lèi)儀器中精度稍高的都在使用電感耦合陣列檢測(cè) 器（CCD），其光譜范圍、量子效率、信噪比等指標(biāo) 都遠(yuǎn)高于光電二極管陣列。 使用該類(lèi)儀器多用其基座檢測(cè)模式，該功能是 實(shí)現(xiàn)微量測(cè)試的關(guān)鍵技術(shù)。即，用微量移液槍吸取 樣品滴加在檢測(cè)基座上，基座上包埋了一根接受光 纖，放下檢測(cè)臂與液體接觸，檢測(cè)臂上有檢測(cè)光纖， 應(yīng)用液體的表面張力在檢測(cè)基座和檢測(cè)臂之間自動(dòng) 形成標(biāo)準(zhǔn)液柱。液柱高度相當(dāng)于光程，液柱高度可 設(shè)定為 0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm 等。光源發(fā)出的光與普通的分光光度計(jì)相比，從點(diǎn)樣到測(cè)試完成 的時(shí)間大大縮短，且省去了清洗比色皿的程序。該 檢測(cè)基座只需用拭鏡紙擦拭即可。該類(lèi)儀器可以實(shí) 現(xiàn)的檢測(cè)功能如下：普通的紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì) 檢測(cè)、DNA/RNA 濃度檢測(cè)、蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)等。

2 微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)方法分析 通過(guò)查閱資料，現(xiàn)有的微量分光光度計(jì)普遍具 有的技術(shù)參數(shù)，如表 1 所示。 與普通的分光光度計(jì)比較，一些基本的技術(shù)參數(shù)還是比較一致的。但是該類(lèi)儀器預(yù)設(shè)了 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、熒光染料吸光度值與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系， 所以可以直接給出這些樣品的濃度值。根據(jù)以上技 術(shù)參數(shù)及測(cè)試原理，對(duì)微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)就有 兩種思路， 一是從分光光度計(jì)的原理參照普通分光 光度計(jì)的檢定規(guī)程 JJG 178-2007《紫外、可見(jiàn)、近 紅外分光光度計(jì)》來(lái)校準(zhǔn)，另一種思路是從該類(lèi)儀 器的測(cè)量結(jié)果入手，以濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)校準(zhǔn)其測(cè)量 值的示值誤差等。下面對(duì)兩種思路做分析對(duì)比，并 給出合理建議。 

2.1 以濾光液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn) 該方法可以參照 JJG 178-2007 進(jìn)行部分項(xiàng)目的 校準(zhǔn)?？蓪⒉ㄩL(zhǎng)準(zhǔn)確性、波長(zhǎng)重復(fù)性、吸光度準(zhǔn)確 性、雜散光等儀器主要關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)列為校準(zhǔn)項(xiàng) 目。對(duì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確性和波長(zhǎng)重復(fù)性的校準(zhǔn)可以使用現(xiàn) 有的氧化鈥波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng) 240 ～ 650 nm 范圍有 10 個(gè)以上尖銳、峰位明確的吸 收峰。吸光度的準(zhǔn)確性可以使用 JJG 178-2007 給出 的方法，配制一定濃度的重鉻酸鉀高氯酸溶液或重 鉻酸鉀硫酸溶液，用高精度的紫外可見(jiàn)風(fēng)光光度計(jì) 定值其在 235 nm、257 nm、313 nm、350 nm 處的吸 光度值。通常是在光程為 10 mm 定值，使用時(shí)可根 據(jù)朗伯比爾定律 A = - kLc 來(lái)轉(zhuǎn)換更小光程時(shí)的吸光 度值，當(dāng)儀器給出的是標(biāo)準(zhǔn)為光程 10 mm 的吸光值 時(shí)則不需要將標(biāo)準(zhǔn)值換算即可進(jìn)行比較。其次要注 意校準(zhǔn)時(shí)環(huán)境溫度與定值時(shí)溫度的匹配性。雜散光 特性可以根據(jù) JJG 178-2007 的要求使用 10 g/L 的 溶液和 50 g/L 的分別在 220 nm 和 340 nm 處檢測(cè)儀器的透光率或吸光度值。以上校準(zhǔn) 方式和項(xiàng)目是基于微量分光光度計(jì)的測(cè)量原理，結(jié) 合生產(chǎn)商給出的技術(shù)參數(shù)，使用者可以利用校準(zhǔn)結(jié) 果對(duì)被校儀器有一個(gè)綜合的評(píng)價(jià)。此外，如果希望進(jìn)一步了解儀器的基線平直度和基線噪聲等指標(biāo)也 可參照 JJG 178-2007 來(lái)制定校準(zhǔn)方法。 

2.2 以濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn) 該方法是在微量分光光度計(jì)可以直接測(cè)定核酸 和蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的含量值基礎(chǔ)上，以 DNA 標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)、RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)的測(cè)量值與標(biāo)注值之差作為儀器的示值誤差來(lái)評(píng) 價(jià)儀器的計(jì)量特性。該類(lèi)儀器預(yù)設(shè)了定點(diǎn)波長(zhǎng)測(cè)試 功能，并且預(yù)設(shè)了吸光度值與濃度值的關(guān)系。核酸 和蛋白質(zhì)的大吸收波長(zhǎng) 260 nm、280 nm，為了判 斷核酸或蛋白質(zhì)的純度還增加了 A230 nm 用來(lái)表示 樣品中存在的一些污染物如碳水化合物、、多 肽等，A320 nm 用來(lái)表示樣品的渾濁度和其他干擾 因子。用濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)校準(zhǔn)該類(lèi)儀器還可以將測(cè) 量值的重復(fù)性和儀器的線性納入校準(zhǔn)項(xiàng)目，當(dāng)然儀 器線性的評(píng)價(jià)需要用到不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。 3 結(jié)語(yǔ) 綜合上述分析，種校準(zhǔn)方式在稍加細(xì)化的 基礎(chǔ)上即可以開(kāi)展校準(zhǔn)工作，且對(duì)于廣大的計(jì)量工 作者來(lái)講比較容易上手，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格較低且容易 獲得。而后一種校準(zhǔn)方式雖然可以給出微量分光光 度計(jì)的測(cè)量結(jié)果的示值誤差、線性等計(jì)量特性優(yōu)劣， 但在實(shí)際校準(zhǔn)過(guò)程中如何選定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，僅單一標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)還是核酸類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)共同使用，因?yàn)閮烧?是在不同的吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行定量測(cè)量，考查的是不 同波長(zhǎng)下濃度測(cè)量的準(zhǔn)確性。而且還需要考慮 DNA 或 RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及蛋白紙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性、經(jīng) 濟(jì)性和易獲得性，且對(duì)存儲(chǔ)條件的要求不能太高， 尤其是有些 DNA 含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的存儲(chǔ)溫度要求較 低，不便于計(jì)量工作人員進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)校準(zhǔn)。所以在 JJG 178-2007 的基礎(chǔ)上研制一套系列標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)該類(lèi)儀 器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確性、吸光度準(zhǔn)確性、雜散光等計(jì)量特 性進(jìn)行校準(zhǔn)，通過(guò)校準(zhǔn)結(jié)果可以客觀、全面地評(píng)價(jià) 儀器的技術(shù)指標(biāo)，給使用者了解該儀器提供更加綜 合的數(shù)據(jù)。