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細(xì)胞冷凍保存方法?步驟與注意事項(xiàng)

來源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司   2024年10月21日 16:10  
冷凍保存方法:
1、傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16~18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。
-20℃不可超過1小時(shí),以防止胞內(nèi)冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
2、程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3、步驟:
(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養(yǎng)基、血清,逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。
(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液,并晃動試管,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO最后濃度為5~10%),使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示全之冷凍保存管中,1~2ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。
注意事項(xiàng):
(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80~90%致密度。冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其te有性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
(2)細(xì)胞在液氮中可長期凍存無限shi間,而不會影響細(xì)胞活力;在-70度可保存數(shù)月。
(3)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲,可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化,可換用10%甘油凍存。
(4)冷凍保存之細(xì)胞濃度:
①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死qu。
③adherent tumor lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(5)冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。
(6)、凍存可用10%~90%的血清,一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力,此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4度時(shí)),復(fù)蘇存活率在80%~90%以上,對原代培養(yǎng)細(xì)胞,以90%血清凍存更為有效。



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