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ELISA實驗就是酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是將抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面,利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及抗體或者抗原上標(biāo)記的酶催化特定底物發(fā)生顯色反應(yīng),實現(xiàn)目標(biāo)物檢測的免疫分析方法,可測至皮摩爾(pmol)級別。
ELISA常見類型:
直接法:
將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上,然后加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體,孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。
特點:
適用于檢測小分子抗原,優(yōu)勢:實驗步驟少,檢測速度快,無須使用二抗可避免交互反應(yīng),結(jié)果較準(zhǔn)確。缺點:每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實驗靈活性低,靈敏度低。
間接法:
將已知抗原連接在固相載體上,待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合,形成抗原一待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物,復(fù)合物的形成量與待測抗體量成正比,屬非競爭性反應(yīng)類型。
特點:
常用于抗體的檢測,只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標(biāo)抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。優(yōu)勢:二抗可以加強(qiáng)信號,而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標(biāo)記的一級抗體則能保留它多的免疫反應(yīng)性。缺點:可能會發(fā)生交叉反應(yīng),與直接法比,實驗周期長。
夾心法:
類型:分為直接夾心和間接夾心。檢測抗體是酶標(biāo)抗體,則可稱為直接夾心ELISA;檢測抗體不帶有標(biāo)記,則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合,這種稱為間接夾心ELISA。
直接夾心又分為雙抗體夾心和雙抗原夾心。夾心ELISA實驗需要用到配對抗體(捕獲抗體和檢測抗體),原理:將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上,通過捕獲抗體固定抗原,隨后通過直接或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測。在夾心ELISA實驗中,最重要的是對配對抗體進(jìn)行驗證,確保配對抗體能同時與抗原結(jié)合,以確保實驗的順利進(jìn)行。
特點:
常用于抗原測定,適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,不適用于測定半抗原及小分子單價抗原。優(yōu)點:高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化。缺點:抗原一定得擁有兩個以上的抗體結(jié)合部位。
競爭法:
首先將特異性抗體吸附于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液;而另一組只加酶標(biāo)記抗原,再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可。
特點:
常測定小分子抗原:如激素和藥物之類,也可以用來檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時,由于空間位阻的影響,使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。優(yōu)勢:可適用不純的樣本,快速高效。 缺點:整體的敏感性和專一性都較差。
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