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PCR反應(yīng)體系的組成與優(yōu)化

來源:上海邦景實(shí)業(yè)有限公司   2024年09月29日 10:57  

        PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分組成。各個組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。
1. 反應(yīng)緩沖液:一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含:50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH8.3室溫),1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高,使反應(yīng)特異性降低;濃度過低,使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時,Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物,可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時,也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn),一般以1.5-2mM(終濃度)較好。
2. dNTP :高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入,過高則可能不擴(kuò)增;但濃度過低,將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同,如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用,降低合成速度,過早終止延伸反應(yīng)。此外,dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。因此,dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3. Taq DNA聚合酶酶:在100μl反應(yīng)體系中,一般加入2-4U的酶量,足以達(dá)到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是,不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異,由于酶的濃度對PCR反應(yīng)影響極大,因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(如20μl或50μl),一般酶的用量仍不小于2U,否則反應(yīng)效率將降低。
4. 引物:引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵,引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則:
⑴ 引物的長度以15-30bp為宜,一般(G+C)的含量在45-55%,Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。
⑵ 引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ),避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu),兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性,以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個,引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多,現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高,濃度過高有兩個弊端:一是容易形成引物二聚體(primer-dimer),二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時,容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來,用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì),而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。
⑸ 引物一般用TE配制成較高濃度的母液(約100μM),保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5. 模板:PCR對模板的要求不高,單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品(甚至是來自單一細(xì)胞的DNA)作為摸板,但為了保證反應(yīng)的特異性,一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品,某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增,但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白,將可能干擾PCR反應(yīng)。
6. PCR循環(huán)加快,即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間,可增加產(chǎn)物的特異性。

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