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摘 要

使用具有 CarboMAX™ 偶聯(lián)方法的 Liberty Blue™ 自動(dòng)微波肽合成儀能進(jìn)行難以合成的磷酸肽的高效合成。微波能量的使用被證明對(duì)于偶聯(lián)龐大的磷酸氨基酸衍生物非常有效，而使用CarboMAX 偶聯(lián)方法可以在高溫下保護(hù)酸不穩(wěn)定的受保護(hù)磷酸基團(tuán)，從而最大限度地減少副反應(yīng)。使用這種方法，在不到 2 小時(shí)內(nèi)分別組裝了以下磷酸肽：CTEDQY(pS)，LVED-NH₂（82% 純度）、CPSPA(pT)DPSLY-NH₂（73%純度）和CSDGG(pY)MDMSK-NH₂（62% 純度）。

簡(jiǎn) 介

磷酸化是一種翻譯后修飾 (PTM)，它涉及將磷酸基團(tuán)引入肽或蛋白質(zhì)的蘇氨酉夋、絲氨酉夋或酪氨酉夋殘基上¹。酶促磷酸化調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)的功能并引導(dǎo)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)²。由于磷酸化在生物學(xué)中的不可或缶夬的作用，近年來對(duì)磷酸化肽合成的興趣穩(wěn)步增長(zhǎng)，特別是隨著細(xì)胞生物學(xué)家和蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員尋求更好地理解和表征磷酸化蛋白質(zhì)組³。最初，磷酸化肽的生產(chǎn)需要合成整個(gè)肽，然后是合成后的磷酸化步驟。這種合成后方法通常難以實(shí)施，而且經(jīng)常產(chǎn)生不純的肽⁴。引入 Fmoc 衍生的單芐基保護(hù)的磷酸氨基酸，例如 FmocThr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH 和 FmocTyr(PO(OBzl)OH-OH（圖1）顯著改進(jìn)了合成過程，并成功實(shí)現(xiàn)了 SPPS 的自動(dòng)化，適用于各種磷酸肽。⁵

圖1. Fmoc 衍生的單芐基保護(hù)的磷酸氨基酸

微波能已被用于合成磷酸肽。先前已證明偶聯(lián)磷酸氨基酸后的第一次脫保護(hù)應(yīng)在室溫下進(jìn)行，以防止受保護(hù)的磷酸基團(tuán)的β-消除。此外磷酸鍵對(duì)酸不穩(wěn)定，因此在碳二亞胺偶聯(lián)過程中易于在高溫下去除。使用 0.4 當(dāng)量 DIEA 的 CarboMAX 方法對(duì)于穩(wěn)定酸敏感鍵（包括受保護(hù)的磷酸基團(tuán)）非常有效。CarboMAX 最近被證明可以成功合成含有 3 個(gè)受保護(hù)的磷酸基團(tuán)的磷酸肽。微波偶聯(lián)步驟已被證明可以改善磷酸化殘基的直接和后續(xù)偶聯(lián)，并最大限度地減少去磷酸化和缺失產(chǎn)物 (CarboMAX)⁶。

材 料 和 方 法

試 劑

所有氨基酸均獲自 CEM Corporation (Matthews, NC) ，并含有以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Asn (Trt)、Asp (OMpe)、Cys (Trt)、Gln (Trt)、Glu (OtBu)、Lys( Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)。Fmoc 單芐基保護(hù)的磷酸氨基酸也得自 CEM Corporation (Matthews, NC)：N-α-Fmoc-O-芐基-L-磷酸絲氨酉夋 (pS)、N-α- Fmoc-O-芐基-L-磷酸酪氨酉夋 (pY)、和 N-α-Fmoc-O-芐基-L-磷酸蘇氨酉夋 (pT)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTide™ LL 樹脂購(gòu)自CEM Corporation (Matthews, NC) 。N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC) 購(gòu)自 CreoSalus (Louisville, KY)。哌啶獲自Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙酉夋 (TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷 (TIS)、N,N-二異丙基乙胺 (DIEA) 茴香硫醚和乙酸購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO）。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和無水乙酉迷 (Et₂O) 購(gòu)自 VWR (West Chester, PA) 。LCMS 級(jí)水 (H₂O) 和 LCMS 級(jí)乙腈(MeCN) 購(gòu)自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多 肽 合 成

使 用 CEM Liberty Blue 自 動(dòng) 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂（0.20 meq/g  取代）上以 0.1 mmol 規(guī)模制備肽。用哌啶和 Oxyma Pure 在 DMF 中進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)使 用 5 倍 過 量 的 Fmoc-AA-OH、DMF 中 的 DIC 和 DMF (CarboMAX) 中的 Oxyma Pure/DIEA 進(jìn)行。⁶在 CEM Razor™ 上使用 TFA/茴香硫醚/TIS/H₂O/DODT 進(jìn)行裂解平行肽切割系統(tǒng)。裂解后，肽在無水乙酉迷中沉淀并凍干過夜。

結(jié) 果

在 Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上 CTEDQY(pS)LVED-NH₂ 的微波增強(qiáng) SPPS 產(chǎn)生了純度為 82% 的目標(biāo)肽（圖2）。沒有觀察到 Tyr 缺失。CPSPA(pT)DPSL Y-NH₂ 的微波增強(qiáng) SPPS 產(chǎn)生了73% 純度的目標(biāo)肽（圖3）。觀察到少量7-11位氨基酸的截?cái)唷SDGG(pY) MDMSK-NH₂ 的微波增強(qiáng) SPPS 產(chǎn)生了 62% 純度的目標(biāo)肽（圖4）。觀察到最小的天冬酰胺形成和甲硫氨酉夋氧化。

圖2. CTEDQY(pS)LVED-NH2的UPLC色譜

圖3. CPSPA(pT)DPSLY-NH2的UPLC色譜

圖4. CSDGG(pY)MDMSK-NH2的UPLC色譜

結(jié) 論

Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上的微波增強(qiáng)型 SPPS 可快速高效地生產(chǎn)高質(zhì)量的磷酸肽，例如 CTEDQY(pS)LVEDNH₂、CPSPA(pT)DPSLY-NH₂ 和 CSDGG(pY)MDMSK-NH₂。插入磷酸絲氨酉夋后的室溫去保護(hù)最大限度地減少了CTEDQY(pS)LVED-NH₂ 合成中的去磷酸化。使用 Fmoc-Asp(OMpe)-OH 可最大限度地減少敏感序列中天冬酰胺形成的發(fā)生，尤其是 CSDGG(pY)MDMSK-NH₂。微波增強(qiáng)的 SPPS 可以改善磷酸化殘基的直接和后續(xù)偶聯(lián)，同時(shí)最大限度地減少不必要的副反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

(1) Prabakaran, S.; Lippens, G.; Steen, H.; Gunawardena, J. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2012, 4 (6), 565–583.

(2) Chen, J.; Shinde, S.; Koch, M.-H.; Eisenacher, M.; Galozzi, S.; Lerari, T.; Barkovits, K.; Subedi, P.; Krüger, R.; Kuhlmann, K.; Sellergren, B.; Helling, S.; Marcus, K. Sci. Rep. 2015, 5 (1), 11438.

(3) Dephoure, N.; Gould, K. L.; Gygi, S. P.; Kellogg, D. R. Mol. Biol. Cell 2013, 24 (5), 535–542.

(4) White, P. D. In Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Chan, W. C., White, P. D., Eds.; Oxford University Press: New York, 2000; pp 187–189.

(5) Perich, J. W.; Ede, N. J.; Eagle, S.; Bray, A. M. Lett. Pept. Sci. 1999, 6 (2/3), 91–97.

(6) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”