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如要對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行精確定量研究，就需要采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物的方式不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要有DNA結(jié)合染料法、基于探針的化學(xué)法、淬滅染料引物法等類型。

1. DNA結(jié)合染料法

原理：應(yīng)用一種帶有熒光的、非特異的DNA結(jié)合染料檢測(cè)PCR過程中積累的擴(kuò)增產(chǎn)物。

應(yīng)用于核算定量和基因表達(dá)驗(yàn)證。

優(yōu)缺點(diǎn)：它們的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)任何雙鏈DNA 進(jìn)行定量，不需要探針，具有相對(duì)高的靈敏度和可靠性，并且成本低，簡(jiǎn)單易用，缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產(chǎn)生的引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，不會(huì)與單鏈DNA結(jié)合，并且在游離狀態(tài)下幾乎無(wú)熒光，只有與雙鏈DNA結(jié)合才會(huì)發(fā)出熒光，因此將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的效果。

2. 基于探針的化學(xué)法

原理：應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；依賴熒光能量共振傳遞檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗(yàn)證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測(cè)、多重PCR。

優(yōu)缺點(diǎn)：探針法的鑒別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DNA結(jié)合染料法，因?yàn)樗鼈冎慌c目的產(chǎn)物結(jié)合，從不與引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物結(jié)合，缺點(diǎn)是它的合成價(jià)格高。

探針法中的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端，PCR擴(kuò)增時(shí)在加入引物的同時(shí)加入探針，探針完整時(shí)，熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR擴(kuò)增時(shí)，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而檢測(cè)器可以接收到熒光信號(hào)。

圖3 TaqMan探針熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制

3. 淬滅染料引物法

原理：采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗(yàn)證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測(cè)、多重PCR

優(yōu)缺點(diǎn)：探針和目標(biāo)片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此減少了背景熒光和假陽(yáng)性，還可進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，缺點(diǎn)是原料成本價(jià)格高。