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2.細(xì)胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤(rùn)切片30min（RT 避光），降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

3.抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新“滿血復(fù)活”。

比較常用的是微波修復(fù)，pH 6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù)2次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS洗3次，3 min/次。

4.血清封閉：用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用油性筆圍繞組織畫圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃溫箱中30min,用濾紙吸去多余的血清。

5.孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的一抗20ul，4℃過夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。（一般4℃過夜后，需要將切片放置37℃復(fù)溫45min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）

6.孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

7.切片顯色：用DAB-H2O2顯色10min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10min內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。

8.復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用Mayer蘇木素染色30s，水洗，鹽酸酒精分化2s，流水浸入15min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性樹膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。 

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