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滬鼎生物|哪些因素會導(dǎo)致ELISA實驗假陽性?

來源:上海滬鼎生物科技有限公司   2023年07月20日 10:36  

ELISA法對IgG、IgM都有很好的檢測能力,因其靈敏度高,價格低廉,操作方便,結(jié)果客觀,在實驗室廣泛應(yīng)用,但在工作中遇到的zui大的問題是出現(xiàn)假陽性的問題。影響因素除了方法學(xué)、試劑盒本身之外,還有標本處理、操作不當?shù)榷喾N因素,雙試劑兩組結(jié)果進行配對t檢驗,差異(P>0.05)均無統(tǒng)計學(xué)意義。


多種因素可能會導(dǎo)致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值,除了嚴格操作、做好質(zhì)控外,對可疑假陽性的標本一定要認真復(fù)測。為避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)現(xiàn)將產(chǎn)生假陽性的原因分析如下:

1、內(nèi)源性因素

(1)年齡因素

    老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常,產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

(2)疾病因素

    類風濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體,自身抗體、類風濕因子等,這些特殊成分在反應(yīng)過程中有一定的吸附作用,多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性。

2、標本因素

(1)標本處理不chedi

    血液抽出后未wan全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原wan全析出,加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物,造成洗板不che底干凈,酶殘留在反應(yīng)孔中,使反應(yīng)孔吸光度值偏高,出現(xiàn)假陽性,待測血清中混有纖維蛋白原,這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯空內(nèi)不易洗凈,試驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000/min)和較長的離心時間(>10/min)之上,血液標本被充分地離心分離后,使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結(jié)果的影響。

(2)標本溶血

    標本溶血時細胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結(jié)合,洗滌時不易洗去,催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應(yīng),使本底吸光度值偏高形成假陽性。

(3)細菌污染

    標本放置、處置不當被細菌污染,一些細菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會對相應(yīng)的酶做標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾,造成弱的假陽性反應(yīng)。

3、操作因素

    聚苯乙烯因其具有較長的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗的固相載體,聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過洗滌清楚在反應(yīng)過程中,非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻決定著試驗的成敗,可以在加樣前離心時得以控制,同樣也可以通過適當增加洗滌的次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對試驗結(jié)果的影響,同樣對于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時將其去除,那么解決的時機就是洗滌過程。

(1)加樣太快,加樣時加在孔壁上或有氣泡。

(2)底物液反復(fù)使用被污染或被強光照射時間過長。

(3)板要平整,尤其是在洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,對實驗結(jié)果造成干擾。

(4)洗液溫度 實驗表明:洗液溫度也會影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板”問題,因此,需保持在室溫在20-30℃。

洗液未注滿孔,孔壁洗滌不干凈也易造成假陽性現(xiàn)象。

(5)洗液要新鮮配置,洗液要臨用前新鮮配置,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或渾濁,造成賭孔導(dǎo)致假陽性。

    洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成假陽性,孵育時間過長也會造成假陽性;由于樣本較多,加樣后未及時放入孵育箱,反應(yīng)板在室溫呆的時間過長,既間接增加了孵育時間,導(dǎo)致孵育時間過長。

4、儀器因素

(1)酶標儀是垂直對反應(yīng)孔比色,反應(yīng)孔底部污染時,出現(xiàn)反應(yīng)孔吸光度值偏高。

(2)洗板拖尾現(xiàn)象,洗板機在洗板過程中,出水針出水不暢,滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴,造成板上水過多,拍板不干凈。

5、方法學(xué)因素

(1)廠家試劑盒,由于不同廠家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致,造成靈敏度和特異性不同,因此也造成了假陽性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測抗體,被某些身體不明抗原干擾,導(dǎo)致的假陽性。

(2)實驗灰區(qū),在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線,作為陽性判定值(cutoff)來判定結(jié)果,一般把檢測值S/COV值在0.6-1范圍內(nèi)時作為灰區(qū)帶,因此當1<S /CO≤0.6時,真反應(yīng)性顯色的可能性小,多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致,實驗室檢測人員應(yīng)依據(jù)實驗檢測結(jié)果,結(jié)合受檢者相應(yīng)病史和個體狀況進行綜合分析,應(yīng)進行確認實驗,避免判定假陽性。

(3)“鉤狀效應(yīng)”的產(chǎn)生,需對標本進行稀釋重復(fù)檢測。

(4)酶標儀的波長選擇,建議酶標儀比色時選擇雙波長,即敏感波長(主波長)和非敏感干擾波長(次波長),zui后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差,排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。


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