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PCR反應出現(xiàn)假陽性,一是引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。
二是靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:
1、整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:
1)、操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。
2)、除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。
3)、必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。
2、空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產(chǎn)物,而導致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。
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