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基本類型:

    酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (以下簡(jiǎn)稱ELISA) ：是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原-抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。

用途:

    根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）;再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

操作程序:

1、間接ELISA

    本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：

(1) 材料

① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；

② DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清；待檢鴨血清；

③ ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

(2) 方法步驟

① 加抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算出P/N比值。

(3) 結(jié)果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

2、雙抗體夾心ELISA

    本法主要用于檢測(cè)大分子抗原。現(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。

① 加抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

3、雙夾心ELISA

    此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。

此法的基本程序?yàn)椋?/span>

① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

⑥ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

4、競(jìng)爭(zhēng)ELISA

    此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)定。

其基本程序?yàn)椋?/span>

① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

④ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

   被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。

5、阻斷ELISA

本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)方法。

下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序：

① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

⑦ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

   本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。

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