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PCR反應(yīng)條件把控

來源：上海邦景實(shí)業(yè)有限公司 2023年03月20日 13:39

PCR反應(yīng)條件的把控
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子。
2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。

3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。

4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

5. 引物濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。?

6. 反應(yīng)溫度

（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時(shí)間低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

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