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基因與細胞治療領(lǐng)域的病毒載體生產(chǎn)用細胞株的開發(fā)

來源：廣州市艾貝泰生物科技有限公司 2022年09月29日 10:51

基因治療被認為是許多嚴重的和危及生命的疾病有效治療手段，得到越來越多人的關(guān)注。同時，基因治療的適應癥正從罕見/極罕見疾病向更常見疾病發(fā)生轉(zhuǎn)變，患者數(shù)量和綜合療法越來越多。因而，大規(guī)模的基因治療病毒載體生產(chǎn)是行業(yè)的迫切需求。

2020年，F(xiàn)DA更新了關(guān)于基因治療臨床試驗申請(INDs)的化學、制造和控制指導原則，內(nèi)容包含穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株開發(fā)及細胞克隆性確證等。文件指出，細胞庫（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個需要考慮的重要方面。非單克隆來源的細胞群中，其細胞異質(zhì)性相對較高，產(chǎn)量低的細胞系往往與高產(chǎn)細胞群體競爭，導致高產(chǎn)細胞個體占比越來越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導致細胞庫或工作庫的質(zhì)量下降，因此，通過單克隆細胞篩選是提高病毒載體產(chǎn)量及質(zhì)量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細胞種群降低其異質(zhì)性的方法，通過防止異種細胞群體的產(chǎn)生，來保障未來生產(chǎn)出的病毒產(chǎn)品的質(zhì)量不受影響。

CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過單克隆篩選出的細胞株其AAV產(chǎn)量要比非單克隆細胞來源的高10倍左右。

張瑰宜博士在“生物藥生產(chǎn)用細胞株構(gòu)建和篩選策略”研討會上分享了她們使用Cytena 的單細胞打印機SCP的感受，其以噴墨式打印技術(shù)溫和而高效的分選單細胞，簡化篩選工作流程，極大的提高了單克隆有效率，獲得了穩(wěn)定性高及一致性好的單克隆，用于后續(xù)的AAV生產(chǎn)，大大的提高了AAV產(chǎn)量。

克隆HEK293細胞的記錄

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HEK293單克隆細胞提高AAV產(chǎn)量

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生物藥生產(chǎn)用細胞株構(gòu)建和篩選策略

英國的葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）藥物研究中心報告了一種如何快速獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)的293T細胞，生成慢病毒載體的方法：將編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結(jié)構(gòu)體穩(wěn)轉(zhuǎn)入293T細胞，單細胞打印機進行單克隆篩選，獲取遺傳學和功能穩(wěn)定的適應懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)用293細胞系。由此產(chǎn)生的懸浮細胞系可生產(chǎn)出與瞬時轉(zhuǎn)染一樣高滴度的病毒，可以在一次性攪拌罐生物反應器中輕松放大，并且在后續(xù)細胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。此方法將降低慢病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)成本，提升慢病毒載體在細胞治療中的應用價值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）

在基因編輯領(lǐng)域，Stephan Riesenberg等學者進行細胞克隆基因型和靶基因拷貝數(shù)分析時使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC，分別用（不用）2 M M3814 處理細胞 3 天后使用單細胞打印機(Cytena)對細胞進行單克隆化用于后續(xù)分析。文章中HEK293 和 K562 細胞的單克隆化也是通過使用單細胞打印機分選單細胞來獲得的。（Stephan R , Manjusha C , Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）

Gross等采用f.sight™單細胞打印機，通過GFP報告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質(zhì)干細胞(MSC)，以進一步增強MSCs在再生醫(yī)學中的治療能力。

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