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近年來，我國IVD產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，國內(nèi)市場容量向千億元級邁進(jìn)。

分子診斷作為體外診斷（IVD）領(lǐng)域發(fā)展迅速的細(xì)分行業(yè)，具有檢測時間短、靈敏度更高、特異性更強(qiáng)等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。

1、分子診斷技術(shù)

分子診斷是指以DNA和RNA核酸為診斷材料，使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測人體是否攜帶病毒基因、是否存在缺陷基因以及是否存在表達(dá)異常。 分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以實現(xiàn)個體遺傳病的診斷，又可以實現(xiàn)腫瘤早篩。

分子診斷大致可分為PCR技術(shù)、基因測序、熒光原位雜交和基因芯片等。

圖1：分子診斷技術(shù)的分類

目前國內(nèi)分子診斷細(xì)分賽道Marketing份額占比分別為：PCR(40%)，分子雜交（35%），生物芯片（16%），其他（9%），PCR技術(shù)占據(jù)了分子診斷半壁江山。

（根據(jù)智研咨詢/國元證券研究中心數(shù)據(jù)調(diào)研）

肆虐世界各地的疫情是分子診斷行業(yè)發(fā)展的催化劑，而PCR技術(shù)是分子診斷中十分常用的檢測手段，作為確診疫情的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

2、PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR（Ploymerase chain reaction）,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，一種核酸（DNA或RNA）體外擴(kuò)增技術(shù)。利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，能在短時間內(nèi)將及微量的特定核酸片段精確復(fù)制出百萬份的拷貝，從而實現(xiàn)對極其微量的DNA或RNA片段進(jìn)行定量。

圖2：PCR反應(yīng)過程

PCR技術(shù)由1983年Kary Mullis初創(chuàng)，被廣泛運用在產(chǎn)前診斷（如乙肝病毒篩查）、腫瘤早篩（如HPV人乳頭瘤病毒檢測）、傳染病檢測（如HIV艾滋病病毒檢測）、呼吸疾病檢測基因檢測(如親子鑒定)等診斷。

圖3：核酸檢測案例

體外診斷RT-PCR試劑盒中包含了模板雙鏈DNA、一對特定序列的引物、一個帶有檢測基因的探針、DNA聚合酶、底物dNTP、緩沖溶液等，那么如何確保DNA能順利進(jìn)行特異性擴(kuò)增？又如何正常標(biāo)記？引物和探針的寡核苷酸原料*。

圖4：PCR反應(yīng)試劑原料

引物和探針的寡核苷酸原料*。

上文提及的引物、探針，和酶等都是IVD原料，即用于制備IVD產(chǎn)品的材料，其品質(zhì)對IVD產(chǎn)品的性能和檢測準(zhǔn)確度影響極大，因此上游環(huán)節(jié)在IVD產(chǎn)業(yè)鏈中話語權(quán)十分強(qiáng)。

然而，長期以來IVD原料生產(chǎn)一直是我國IVD產(chǎn)業(yè)中的卡脖子環(huán)節(jié)。IVD原料市場需求不斷增長，但其背后的核心技術(shù)并未取得相同幅度的進(jìn)步。由于IVD原料的研發(fā)難度較高，國產(chǎn)IVD原料在生產(chǎn)工藝及純度質(zhì)量上仍與進(jìn)口原料存有差距。

隨著我國IVD原料企業(yè)投入大量資金開展基礎(chǔ)研究與開發(fā)工作，其研發(fā)創(chuàng)新能力與原料工藝質(zhì)量不斷提升。那么我們先來了解一下，生產(chǎn)這些上游原料的要點及難點。

引物

引物的特異性是PCR特異性的關(guān)鍵，引物是具有*靶向序列的短鏈寡核苷酸片段，幫助識別基因組的*性。通過引物特異性結(jié)合在目標(biāo)區(qū)域，作為DNA復(fù)制開始時DNA聚合酶的結(jié)合位點。不純的引物不但會直接影響RT-PCR的特異性和定量不準(zhǔn)，還會影響后續(xù)的測序?qū)嶒灐?/span>

引物不純可能會導(dǎo)致：

1)非特異性擴(kuò)增；

2)無法用預(yù)先設(shè)計在引物5′端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護(hù)堿基的引物；

3) 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。

圖5：引物

探針

TaqMan熒光探針是一種具有熒光基團(tuán)的特定寡核苷酸片段，通過檢測熒光分子的信號強(qiáng)度即可知道PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量，每擴(kuò)增一條DNA子鏈，就有一個熒光分子發(fā)出信號。

圖6：Taqman探針

無論是PCR反應(yīng)還是NGS測序等核酸水平的分子診斷技術(shù)，都需要優(yōu)質(zhì)的引物和探針，確保診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。必須對合成后的寡核苷酸片段進(jìn)行純化處理，得到符合純度要求的PCR試劑盒的原料，再銷售至下游生產(chǎn)核酸試劑盒的廠家。

3、如何得到優(yōu)質(zhì)或高純度的引物探針？

引物/探針等寡核苷酸通過自動核酸合成儀合成之后，需要通過不同的分離純化方式（比如脫鹽過柱法或RP-HPLC方法）。

圖7：HPLC純化

RP-HPLC制備型反向高效液相色譜法是引物/探針常用的純化方法之一，其優(yōu)點是純度高（高達(dá)99%）、自動化程度高。純化后需要使用相關(guān)的溶劑蒸發(fā)設(shè)備去除其有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇、水等）后，一般包裝至EP管或者96孔板中。

然而，使用傳統(tǒng)濃縮方法去除這些溶劑時，如果控制不當(dāng)，未必能使溶劑蒸發(fā)*，會影響引物和探針的一致性和純度。

為防止樣品暴沸，需要在溶劑蒸發(fā)過程的控制好抽真空速率，Genevac大容量核酸合成濃縮儀（圖7）利用控制真空度和離心力，可以有效防止暴沸避免交叉污染。

圖8：真空離心濃縮儀  

4、爭分奪秒|分子診斷的新趨勢

隨著核酸檢測常態(tài)化發(fā)展，大量的試劑盒被用于每日的核酸檢測。分子診斷新趨勢是更快，更準(zhǔn)！

采樣快速——5月9日，Joint Prevention and Control Mechanism of the State Council提出，大城市要建立步行15分鐘核酸“采樣圈”。

檢測快速——截至5月12日，上海市的核酸檢測能力現(xiàn)在也達(dá)到了每天800萬管以上。

(數(shù)據(jù)來源：*)

5、為上海市復(fù)工復(fù)產(chǎn)做準(zhǔn)備

按照六月以后復(fù)工復(fù)產(chǎn)的要求，每人每周需要進(jìn)行兩次的核酸檢測，根據(jù)上海市常住人口數(shù)量2500萬，除去退休人員，小孩子，無業(yè)人員，至少有60%的人員需要參加這些檢測，也就是說每天至少消耗越428萬管的檢測試劑。

面對日均如此大需求量的檢測試劑盒，上游原材料的質(zhì)量和供應(yīng)速度應(yīng)該同幅度進(jìn)步和增長，在引物和探針的制備過程中，使用高通量的真空離心濃縮設(shè)備可以大幅度提高生產(chǎn)效率，溶劑蒸發(fā)的速度起到四兩撥千斤的作用。

接下來介紹一款大容量核酸合成濃縮儀miVac Quattro，它的樣品通量是傳統(tǒng)的氮吹濃縮儀的5倍+，大幅度提高了蒸發(fā)容量和節(jié)約蒸發(fā)時間。在核酸合成中十分常用的1.5ml EP管可以同時濃縮200位樣品，另外兼容96孔板，最多可同時容納20個淺孔微孔板或8個深孔板。

圖9：miVac Quattro大容量核酸合成濃縮儀

圖10： 多樣的轉(zhuǎn)子類型

提高濃縮速度的秘訣是提高熱傳導(dǎo)率。

下圖使用不同條件下的樣品濃縮速度，Genevac通過一系列措施促進(jìn)熱量向樣品傳導(dǎo)，在濃縮速度上有顯著提升，助力引物/探針試劑高效率生產(chǎn)。

圖11：不同條件下的提升濃縮速度

①實心鋁制轉(zhuǎn)子——相比塑料轉(zhuǎn)子或空心轉(zhuǎn)子，*的實心鋁制轉(zhuǎn)子具有良好的熱傳導(dǎo)效果，即使在真空條件下也能有效傳遞熱量。

②腔體預(yù)熱功能——結(jié)合腔體預(yù)熱功能，能有效提升濃縮速度。

③高效率的SpeedTrap™冷阱——新型的冷阱線圈制冷，能冷凝回收95%以上的有機(jī)溶劑。

圖12：Speedtrap冷阱

一款安全、可控、快速、高通量的濃縮儀，可以更大程度地減輕工作負(fù)擔(dān)，高效助力生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的IDV原料，用戶僅需設(shè)置溫度，一鍵選擇醇或水的方法，然后按下啟動鍵即可使用。

寡核苷酸除了在IVD中扮演重要角色，現(xiàn)在作為創(chuàng)新藥的熱門選手，也承載了很多科研人員的希望，下一期我們就來聊聊Oligo藥物篩選的那些事。

原理介紹：

Genevac miVac是由離心腔、冷阱、真空泵三部分組成真空離心濃縮儀，用于對寡核苷酸、核酸等樣品進(jìn)行濃縮、純化、干燥，適用于oligo合成、RNA/DNA制備、肽制備、測序、分子生物學(xué)和ADME/毒理學(xué)研究。

抽真空：利用壓力降低時，溶劑的沸點也隨著降低。使生物樣品能在較低的溫度條件下進(jìn)行溶劑蒸發(fā)。加快蒸發(fā)效率的同時，可防止熱敏感樣品失活。

離心：為了避免樣品暴沸和交叉污染，采用高速離心旋轉(zhuǎn)技術(shù)，離心力的作用下可以有效防止暴沸和樣品損失，干燥后的溶質(zhì)*沉積在容器的底部，便于樣品的*回收。

熱量：加速樣品的蒸發(fā)速率。

英國GeneVac公司成立于1990 年，隸屬SP Scientific 旗下，一直專注于研究和生產(chǎn)各種離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備，不斷為生命科學(xué)提供更前沿和優(yōu)質(zhì)的解決方案。