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三陰性乳腺癌是一種具有臨床侵襲性的腫瘤亞型, 具有高轉(zhuǎn)移率, 復(fù)發(fā)率和耐藥性。目前還沒有臨床批準(zhǔn)的針對(duì)這種疾病的小分子靶向療法, 所以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)有著迫切需要。源自患者的基于細(xì)胞的3D 癌癥模型是癌癥研究,藥物開發(fā)和個(gè)性化醫(yī)療的非常有價(jià)值的工具。原代腫瘤衍生模型可以概括腫瘤異質(zhì)性和形態(tài), 以及復(fù)雜的遺傳和分子組成, 從而加速藥物開發(fā)和藥物測(cè)試。然而, 執(zhí)行 3D 檢測(cè)的復(fù)雜性仍然是采用這種化合物篩選方法的障礙。
在本研究中, 我們描述了一種成像和細(xì)胞培養(yǎng)方法的自動(dòng)化, 這些方法可以批量進(jìn)行復(fù)雜的基于3D細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。我們開發(fā)了一個(gè)整合的工作單元, 其中包括一臺(tái)IXM-C HT.ai共聚焦成像系統(tǒng),一臺(tái)自動(dòng)化CO2培養(yǎng)箱, 一臺(tái)自動(dòng)化移液工作站(Biomek i7),和一臺(tái)協(xié)作機(jī)械臂。 工作單元流程設(shè)置能通過高內(nèi)涵成像實(shí)現(xiàn)化合物測(cè)試自動(dòng)化, 培養(yǎng)監(jiān)測(cè), 以及藥物表型效應(yīng)的評(píng)價(jià)。 腫瘤類器官由分離自患者來源的腫瘤TU-BcX-4IC原代細(xì)胞形成, 該外植體代表具有三陰性乳腺癌亞型的化生性乳腺癌。在與化合物一起孵育期間, 每天使用透射光成像監(jiān)測(cè)腫瘤類器官,借助基于機(jī)器學(xué)習(xí)的圖像分析, 可以表征腫瘤類器官的大小, 直徑, 完整性和光密度。對(duì)于終點(diǎn)測(cè)定, 腫瘤類器官用細(xì)胞活性染料染色并使用自動(dòng)共焦成像系統(tǒng)成像。我們表征了多個(gè)可用于研究腫瘤表型和化合物效應(yīng)的定量參數(shù),包括大小和完整性, 細(xì)胞形態(tài)和活力, 以及確定各種細(xì)胞標(biāo)志物的存在和表達(dá)水平。

產(chǎn)生腫瘤類器官和PDX類器官的方法 (PDXO) 如之前所述(Matossian 等人2021)。 將原發(fā)性腫瘤樣本植入SCID/Beige小鼠體內(nèi)并表現(xiàn)出快速的腫瘤生長, 14 天達(dá)到最大腫瘤體積>1000 mm3, 然后從 2D 培養(yǎng)中擴(kuò)增的樣本中生成細(xì)胞系。 腫瘤類器官由2D擴(kuò)增的 4IC 細(xì)胞形成的。 4IC 細(xì)胞每孔鋪約2000個(gè) (在U 型底低吸附384 板中, Corning) 并孵育48小時(shí), 直到它們形成緊密的腫瘤類器官。 4IC 細(xì)胞使用帶補(bǔ)充葡萄糖的Advanced DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)含有 NEAA,2mM glutamine和胰島素 120μg/L, 10% FBS (Gibco12491-015)。 對(duì)于代謝測(cè)定,類腫瘤用DMEM + 10% 透析血清培養(yǎng)(2mM glutamine,5mM 葡萄糖,無酚紅)。

細(xì)胞監(jiān)測(cè)和成像
在 ImageXpress Confocal HT.ai 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(MolecularDevices)上使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像分析軟件采集熒光圖像和透射光 (TL) 。 腫瘤類器官圖像在 TL 中獲得, 間隔約
60 μm。 Z-圖片組圖像是通過 10X 或 20X 物鏡使用共聚焦模式獲得的。使用MetaXpress或 IN Carta™進(jìn)行分析。
細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)化和成像流程
類器官的自動(dòng)成像和分析對(duì)于定量評(píng)估類器官的表型變化以及增加實(shí)驗(yàn)和測(cè)試的通量非常重要。我們構(gòu)建了一個(gè)自動(dòng)化的集成系統(tǒng), 可以自動(dòng)監(jiān)測(cè), 維護(hù)和表征類器官和干細(xì)胞的生長和分化, 以及測(cè)試各種化合物的效果。自動(dòng)化系統(tǒng)包括 ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)和分析軟件, 自動(dòng)化CO2 培養(yǎng)箱, Biomek i7移液工作站, 機(jī)械臂和軌道。 由GreenButton Go 解決方案實(shí)現(xiàn)機(jī)械自動(dòng)化。

Figure 1. A.腫瘤類器官形成在鋪板后48h, TL圖像 (10X)。 B.化合物處理后的培養(yǎng)的腫瘤類器官。 C.腫瘤類器官使用
E-cadherin(綠色), CD44(紅色)和Hoechst染色,共聚焦圖像, 20x。 D.腫瘤類器官以化合物處理5天然后用Hoechst染料(藍(lán)色), 鈣黃綠素AM (綠色) and EtHD
(紅色)染色, 10X物鏡,類器官以共聚焦選項(xiàng)成像, 15張圖像的Z-圖片組每張間隔10 µm,展示的是最大投影疊加圖像。 使用Custom Module Editor
(MetaXpress軟件)分析識(shí)別類器官,細(xì)胞核,活細(xì)胞和死細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng), 化合物處理和成像自動(dòng)化
Biomek自動(dòng)化用于化合物稀釋, 細(xì)胞處理和染色。 然后每天通過自動(dòng)成像培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)腫瘤類器官。通過基于AI的圖像分析自動(dòng)檢測(cè)和表征腫瘤表型,密度和大小。對(duì)于終點(diǎn)法測(cè)定, 細(xì)胞用Hoechst,鈣黃綠素AM 和EtHD的組合染色,并使用Custom Module Editor進(jìn)行分析,以進(jìn)行復(fù)雜的表型分析。
鑒定來自NCI 庫的靶向針對(duì)化生性三陰性乳腺癌腫瘤類器官的化合物
3D 腫瘤類器官培養(yǎng)為疾病建模和化合物效應(yīng)評(píng)估提供了非常有用的工具。自動(dòng)化的工作流程允許大批量合物篩選分析, 并提高了分析的重現(xiàn)性和簡(jiǎn)便性。腫瘤類器官的自動(dòng)成像和分析對(duì)于定量評(píng)估腫瘤類器官的表型變化和監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)的復(fù)雜性很重要。來自成像的多種參數(shù)結(jié)果包括腫瘤類器官的大小, 完整性(面積), 不同標(biāo)志物的密度, 細(xì)胞計(jì)數(shù)和其他特征。
我們以5個(gè)濃度10X梯度稀釋測(cè)試了NCI庫中1 68 種化合物的效果: 10nM, 100nM, 1000nM (1μM), 10μM和1 00μM。然后, 我們使用腫瘤類器官完整性 (腫瘤類器官面積)和活力(活細(xì)胞%)的評(píng)估來識(shí)別不同濃度下的Hits化合物。鑒定出了幾種藥物, 這些藥物顯示出了其靶向?qū)鹘y(tǒng)癌癥治療耐藥的腫瘤亞型的功效。下面列出的藥物顯示了其在specified濃度下對(duì)類腫瘤表型的功效(較高濃度也包括列出的較低濃度有效的藥物)。

Figure 2. A. 3D癌癥微組織的自動(dòng)圖像分析是使用透射光圖像 (10X)和In Carta軟件中基于AI的圖像分析完成的(分析圖例以紫色表示)。 B.使用
ImageXpress軟件的Custom Module Editor功能進(jìn)行熒光圖像的終點(diǎn)法分析。 顯示圖像和分析圖例。 對(duì)細(xì)胞評(píng)價(jià)和類器官表征進(jìn)行了多次測(cè)量。

在specified濃度下有效的化合物列表：

所選化合物的劑量反應(yīng)和次級(jí)表征
選擇一組化合物進(jìn)行二次后續(xù)分析。化合物在 1-10000 nM 范圍內(nèi)7個(gè)濃度進(jìn)行了測(cè)試。 EC50值由使用腫瘤類器官解體度測(cè)量來確定的。
結(jié)論
• 我們展示了使用源自原代三陰化生癌細(xì)胞樣品的3D腫瘤類器官的化合物篩選實(shí)驗(yàn)。我們測(cè)試了NCI庫中的168種化合物,涵蓋了多種濃度, 并確定了幾種在3D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示出功效的化合物。
• 通過整合的自動(dòng)成像系統(tǒng), 移液工作站, 自動(dòng)培養(yǎng)箱和協(xié)作機(jī)械臂, 使腫瘤類器官檢測(cè)和化合物處理過程自動(dòng)化。 這些儀器實(shí)現(xiàn)了對(duì)3D細(xì)胞模型進(jìn)行自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng), 維護(hù)和化合物處理, 而使這些3D模型可用于癌癥生物學(xué)化合物篩選。
• 共聚焦成像與3D分析相結(jié)合, 可以對(duì)類器官內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜的定量分析,并對(duì)具有不同表型的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。該方法可用于測(cè)試抗癌化合物的效果和疾病建模。