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中藥活性成分的高效分離與結(jié)構(gòu)鑒定為中藥化 學生物學的重要組成部分，從傳統(tǒng)名貴、療效確切的 中藥中快速發(fā)現(xiàn)活性成分對于闡明藥效物質(zhì)及其作用機制具有重要意義。*是傳統(tǒng)名貴藥材血竭 的代用品，其功效與血竭基本一致，具活血散瘀、定 痛止血、斂瘡生肌之功效。*基原植物百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹 Dracaena cochinchinensis 主要分布在東南亞各國以及我國云南、廣西等地。 現(xiàn)代藥理研究表明*總提物及單體成分具有腦 缺血保護、心肌保護、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理 活性。

高效液相-離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀( 日本島津 公司) ; Varian INOVA-500M 核磁共振儀( 美國 Varian 公司) ; UV-2450 紫外-可見分光光度儀( 日本島 津公司) ; Nexus 470 FT-IＲ 傅立葉變換紅外光譜儀， KBr 壓片( 美國熱點尼高力公司) ; Autopol Ⅳ全自動 旋光測定儀( 美國魯?shù)婪蚬? ; JASCO 815 圓二色 譜測定儀( 日本光電株式會社) ; Milli Q 超純水機 ( 美國 Millipore 公司) ; F-1 型三用紫外分析儀( 江蘇 海門市其林貝爾儀器制造有限公司) ; DZF-6090 真 空干燥箱( 上海申賢恒溫設備廠) ; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 瑞 士步琦公司) ; DLSB-5/20 低溫冷卻液循環(huán)泵( 鄭州長城科工貿(mào)有限公司) ; Buchi C-620 中壓制備液相 色譜儀( 瑞士步琦公司) ; 半制備型高效液相色譜儀 ( 日本島津公司) ; YMC-Pack ODS-A 半制備高效液 相色譜柱( 10 mm × 250 mm，5 μm) ; ODS C18 ( 40 ～ 63 μm，德國 Merck 公司) ; 薄層色譜 GF254硅膠預制 板和柱色譜硅膠( 200 ～ 300 目) 均為青島海洋化工 廠生產(chǎn)。提取分離所用甲醇、乙酸乙酯、石油醚等溶 劑為北京化工廠生產(chǎn)，均為分析純。高效液相所用 溶劑如甲醇、乙腈等為色譜純，水為超純水。 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 ＲAW264. 7( 北 京協(xié)和醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心) ; 超凈工 作臺( 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司) ; CO2 培養(yǎng)箱 ( 日本三洋電機國際貿(mào)易有限公司) ; 倒置生物顯微 鏡( 廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司) ; 多功能酶標 儀( 美國 PerkinElmer 公司) 。陽性藥*( 美 國 Sigma-Aldrich 公司) ; *各萃取部位( DMSO 溶解，質(zhì)量濃度 25. 0 g·L－1 ) 、化合物 1 和 2( DMSO 溶解，濃度 25. 0 mmol·L－1 ) 。 *購買于廣西中醫(yī)學院制藥廠 ( 批 號 ) ，為劍葉龍血樹 D． cochinchinensis 含脂木 材的乙醇提取物，標本存放于北京中醫(yī)藥大學中藥 學院中藥現(xiàn)代研究中心。

*成品 950 g，依次用石油醚、 乙酸乙酯回流提取( 8 L×3，每次 2 h) ，合并提取液， 減壓回收溶劑，得到石油醚提取物 65 g、乙酸乙酯提 取物 600 g、藥渣 265 g。*乙酸乙酯提取物 600 g，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-乙酸乙酯( 10 ∶ 1 ～ 1 ∶3) 、二氯甲烷-甲醇( 20 ∶ 1 ～ 0 ∶ 1) 洗脫，得到 15 個流分( Fr． A ～ O) 。LC-MS 分析發(fā)現(xiàn) Fr． H 為黃酮 寡聚體( 相對分子質(zhì)量大于 500) 的富集部位。Fr． H( 128 g) 經(jīng)過硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯 ( 3 ∶1 ～ 0 ∶1) 洗脫，得到 3 個流分( Fr． H1 ～ H3) 。Fr． H2 經(jīng)中壓制備液相分離( ODS 柱，50 mL·min－1 ， 50% ～ 99% MeOH) 得到 5 個流分( Fr． H2a ～ H2e) 。 Fr． H2b 經(jīng)半制備液相( 甲醇-水 45 ∶ 55) 純化，得到 化合物 1( 10. 5 mg，tＲ 63. 5 min) 。Fr． H2c 經(jīng)半制備 液相( 甲醇-水 58 ∶42) 純化，得到化合物 2( 8. 2 mg， tＲ 38. 3 min) 。

測試條件 Agilent ZOＲBAX SB-C18色 譜柱( 4. 6 mm×250 mm，5 μm) ，流動相為水( 0. 1% 甲酸) ( A) 和乙腈( B) ，梯度洗脫條件如下: 0 ～ 30min，5% ～ 95% B; 流速 1 mL·min－1 。質(zhì)譜分析在正 負離子模式下測定，ESI 作為離子源，檢測電壓 1. 40 kV，飛行時間區(qū)域( TOF) 壓力 1. 5×10－4 Pa; 離子阱 區(qū)域( IT) 壓力 1. 9×10－2 Pa; 干燥氣壓力 100. 0 kPa; 霧化氣流速 1. 5 L·min－1 ; 曲線脫溶劑系統(tǒng)( CDL) 溫 度 200 ℃ ; 掃描范圍 m / z 100 ～ 1 500。

ＲAW264. 7 細胞釋放 NO 活性篩選 活性測試在 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細胞 NO 釋放 模型 上 完 成，具體實驗方法參照文獻。 ＲAW264. 7 細胞用 DMEM 細胞培養(yǎng)液( 含 10% FBS 與 1%青-*雙抗液) 置于 37 ℃，5%CO2 環(huán)境下 濕化培養(yǎng)。細胞以 2×104 個/mL 接種于 96 孔細胞 培養(yǎng)板后，于 37 ℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，用 不同濃度待測萃取部位( 5，50 mg·L－1 ) 、單體化合物 ( 4，20，100 μmol·L－1 ) 作用于 ＲAW264. 7 細胞 1 h 后，加入終質(zhì)量濃度 0. 5 mg·L－1 的 LPS，24 h 后， MTT 方法檢測細胞生長狀況，NO 檢測試劑盒檢測 細胞培養(yǎng)液中 NO 濃度，并計算*各萃取部位 和單體化合物在沒有細胞生長抑制濃度下對 NO 分 泌的抑制率。陽性藥為*。

利 用 LPS 刺 激 的 ＲAW264. 7 細胞 NO 釋放模型測定*總提物、 乙酸乙酯部位、石油醚部位的潛在抗炎活性，結(jié)果表 明在低質(zhì)量濃度( 5 mg·L－1 ) 下，上述部位的 NO 抑 制率分 別 為 ( 3. 9 ± 9. 9) %，( 1. 6 ± 9. 8) %，( 7. 8 ± 4. 8) %，且無明顯的細胞毒作用; 在高質(zhì)量濃度( 50 mg·L－1 ) 下，*乙酸乙酯部位、石油醚部位的 NO 抑制率分別為( 25. 5±4. 5) %，( 5. 6±6. 00) %，無 明顯的細胞毒作用; *總提物顯示出細胞毒作 用，細胞生長抑制率達( 31. 7±1. 5) %。*乙酸 乙酯部位較石油醚部位呈現(xiàn)出更好的抑制 NO 釋放 活性，因此對活性較好的乙酸乙酯部位進一步分離。

經(jīng)過文獻調(diào) 研發(fā)現(xiàn)，*中簡單黃酮相對分子質(zhì)量主要集中 在 250 ～ 350，黃酮二聚體相對分子質(zhì)量在 450 ～ 650， 黃酮三聚體的相對分子質(zhì)量在 700 ～ 800。為了得到 結(jié)構(gòu)新穎的黃酮寡聚體成分，對*乙酸乙酯部 位經(jīng)硅膠柱分離得到的 15 個流分進行 LC-MS 分 析。從 MS1 圖譜中可以發(fā)現(xiàn) Fr． H 中主要色譜峰的 準分子離子峰信號位于 m /z 500 ～ 800，由此判斷該 流分富含黃酮寡聚體類成分。Fr． H 經(jīng)硅膠柱分離得到的各個流分進一步行 LC-MS 分析，其中 Fr． H2 色譜圖呈現(xiàn) 2 個主要色譜峰，負離子模式下顯示準 分子離子峰分別為 799. 315 0( ［M + HCOO］－ ) 和 767. 319 1( ［M－H］－ ) ，結(jié)合二級碎片離子推測其為 黃酮三聚體類成分。選取這 2 個信號其為目標化合 物，進行導向性分離。采用 LC-MS 追蹤，進一步發(fā) 現(xiàn)流分 Fr． H2b，F(xiàn)r． H2c 中分布有目標化合物，行半 制備液相分離純化目標成分。

本文利用活性追蹤并結(jié)合 LC-MS 分析的 方法，從*中快速識別、分離得到了 2 個黃酮三 聚體化合物。其中，化合物 1 為新化合物，化合物 2 為從該種植物中分離得到。本文是發(fā)現(xiàn)該 植物中存在二氫查耳烷環(huán)合型三聚體。化合物 1 和 2 能夠顯著地抑制 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細胞釋放 NO，具有潛在的抗炎作用。本研究為*藥效物 質(zhì)的闡明和進一步開發(fā)利用奠定了基礎。