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老年性癡呆即阿爾茨海默病 ( Alzheimer’s disease， AD) ，目前對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的研究，主要有 Aβ 級(jí)聯(lián)損傷、 tau 蛋白異常磷酸化和神經(jīng)元丟失等幾種假說(shuō)，Aβ 級(jí) 聯(lián)損傷假說(shuō)認(rèn)為，Aβ 在腦內(nèi)的異常沉積引起的一系列神經(jīng) 毒性反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂和死亡，是 AD 發(fā)病的重 要機(jī)制之一，因此減少 Aβ 的生成、促進(jìn) Aβ 清除已成為 治療 AD 的主要方向之一。固本健腦法顧護(hù)先后天之本， 補(bǔ)脾益腎，健腦醒神，兼化痰瘀，臨床運(yùn)用近 20 年，安全有 效。課題組前期從神經(jīng)元樹(shù)突棘、海馬腦區(qū) c － fos 基因等方面對(duì)該法進(jìn)行了研究，本文擬從 Aβ 生成機(jī)制探討 固本健腦法對(duì)淀粉樣前體蛋白( Amyloid precursor protein， APP) 加工及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的影響。

1 材料

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)老年 Wistar 大鼠，12 月齡，雄性，84 只，體質(zhì)量 ( 450 ± 20) g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供， 許可證號(hào): SCXK( 鄂) 2015 － 0018。

1． 2 實(shí)驗(yàn)儀器

Morriss 水迷宮( 中國(guó)醫(yī)學(xué)藥物研究所) ; 腦立體 定位儀( 美國(guó) Stoelting 公司) ; 電泳儀電源( 北京六一儀器 廠，DYY － 7C) ; 垂直電泳槽( 北京六一儀器廠，DYCZ － 24DN) ; 電轉(zhuǎn)儀( 北京六一儀器廠，DYCZ － 40) ; 水平搖床 ( 江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，TS － 1) ; LP115pH 計(jì)( 德國(guó) Metter － Toledo GmbH 公司) ; mμLISKANMK3 酶標(biāo)儀( Thermo) ; 離心機(jī)、CPA 電子天平、數(shù)顯磁力攪拌器、5μL 尖頭微量進(jìn)針器等常規(guī)器材由實(shí)驗(yàn)室提供。

1． 3 實(shí)驗(yàn)試劑

Aβ1 － 42 ( 美 國(guó) Sigma 公 司，批 號(hào): 107761 － 42 － 2 ) ; TEMED( Amresco，Amresc00761) ; 14 － 120 KD 蛋白 marker ( 北京全式金生物技術(shù)有限公司，DM111) ; 10 － 250 KD 蛋 白 marker( fermentas，26619 － 1) ; 0． 45 μmPVDF 膜( Millipore，*H00010 ) ; 羊 多 抗 VPS35，85 KD ( abcam， Ab10099) ; 兔單抗 SorLA，270 KD( abcam，Ab190684) ; 兔單 抗 ASPP，100 － 140 KD( Cell signaling，10176 － 2 － AP) ; ECL 底物液( Thermo，NCI5079) ; X 光膠片( 柯達(dá)，XBT － 1) ; 顯影 定影試劑盒( 天津市漢中攝影材料廠) ; 小鼠單抗 β － actin， 42 KD( BM0627) 、HＲP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗( BA1051) 、HＲP 標(biāo)記 羊 抗 兔 二 抗 ( BA1051 ) 、HＲP 標(biāo)記兔抗羊二抗 ( BA1060) 均由武漢博士德生物工程有限公司提供; 大鼠 Aβ1 － 42ELISA 檢測(cè)試劑盒、磷酸酶抑制劑( S1873) 、PMSF ( ST506) 、ＲIPA 裂解液( P0013B) 、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑 盒( P0010) 由碧云天生物技術(shù)有限公司提供; *、75% 醫(yī)用酒精、3% 過(guò)氧化氫、*、生理鹽水為實(shí)驗(yàn)室自備。

1． 4 實(shí)驗(yàn)藥物

固本健腦法方藥為: 板橋黨參 15 g，枸杞子 15 g，茯苓 15 g，炒酸棗仁 15 g，生山楂 15 g。其中板橋黨參為湖北恩 施道地藥材，由湖北尊生堂中醫(yī)館提供，袁成玉中藥師鑒定 為板橋黨參; 枸杞子、茯苓、炒酸棗仁、生山楂由湖北中醫(yī)藥 大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供。上藥各稱取 750 g，加 6 倍冷水浸泡 30 min，武火煮沸，文火煎煮 30 min，濾出藥液，備用; 二煎加入 2 倍冷水，煎煮 20 min 后濾出，與頭煎所得藥液混合，濃縮。 得含生藥量 2 g /mL 的溶液。 *片( 商品名安理申，Aricept，Donepezil) : 規(guī)格為 5 mg /片，由衛(wèi)材( 中國(guó)) 藥業(yè)有限公司提供，批號(hào): 國(guó)藥準(zhǔn)字 H。研末，溶于滅菌生理鹽水中，磁力攪 拌器攪，配制成濃度為 0． 045 mg /mL 的水溶液。存于 4 ℃ 冰箱，備用。

2 方法

2． 1 模型的建立與藥物干預(yù)

Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d 后，隨機(jī)分為正常組、假手 術(shù)組、模型組、固本健腦液高劑量組( 簡(jiǎn)稱固高組) 、固本健 腦液中劑量組( 簡(jiǎn)稱固中組) 、固本健腦液低劑量組( 簡(jiǎn)稱 固低組) 、西藥組 7 組，每組 12 只。其中正常組不做處理， 假手術(shù)組僅注射生理鹽水 2 μL，其余各組行腦立體定位手 術(shù)注射 Aβ1 － 42造模，具體造模方法如下: 麻醉，備皮，固定， 于兩耳尖連線中點(diǎn)沿正中矢狀線做一長(zhǎng)約 1． 5 cm 切口，暴 露顱骨，用棉簽蘸取 3% 過(guò)氧化氫擦拭，暴露前囟，找到 “十”“人”字縫。參照腦立體定位圖譜，以“十”字縫交叉點(diǎn) 為零坐標(biāo)，將針尖于前囟后 4 mm，左右旁開(kāi) 3 mm 處對(duì)準(zhǔn)并 標(biāo)記，鉆孔。用微量進(jìn)樣器吸取 2 μL Aβ1 － 42，垂直緩慢進(jìn) 針 4 mm，慢速注射 5 min，留針 5 min，緩慢退針。縫合，碘 伏消毒，肌注*，皮外涂抹馬應(yīng)龍*，保暖待蘇醒。 造模 3 d 后，固高組、固中組、固低組、西藥組各組按人 與動(dòng)物體表面積折算法分別按 6． 8、3． 4、1． 7、0． 45 mg / ( kg·d) 灌胃，假手術(shù)組、模型組分別灌以等體積生理鹽 水，連續(xù)灌胃 4 周。

2． 2 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè)

2． 2． 1 取材方法

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，禁食 12 h，稱重， 6% *麻醉后斷頭，迅速于冰盤(pán)上取腦，分離海馬，裝入 2． 5 mL EP 管，標(biāo)記，放入 － 80 ℃冰箱，備用。

2． 2． 2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束后，采用 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間 探查兩部分。向池內(nèi)注入凈水，以高出平臺(tái) 2 cm 為度，倒 入墨水適量，調(diào)試軟件，將大鼠面向池壁分別從四個(gè)象限固 定位置放入水中，記錄大鼠在 90 s 內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間( 逃 避潛伏期) ，如未找到，則將其引導(dǎo)至固定平臺(tái)，停留 10 s， 使大鼠能觀察周圍環(huán)境，結(jié)束后將水擦干，保暖。連續(xù)訓(xùn)練 6 d，第 7 天進(jìn)行空間探查實(shí)驗(yàn)，即撤去平臺(tái)后，按原方法將 大鼠都從任一以象限放入水中，記錄其第 1 次經(jīng)過(guò)原平臺(tái) 的時(shí)間、90 s 內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)等。

2． 2． 3 Westen Blot 檢測(cè)

SorlA、VPS35、APP 的表達(dá) 取組 織塊稱重，勻漿。BCA 法蛋白濃度測(cè)定。配制分離膠與濃 縮膠，上樣，經(jīng) 10% SDS － PAGE 電泳。濕法轉(zhuǎn)移電泳產(chǎn) 物。封閉液浸泡 PVDF 膜，室溫?fù)u床封閉 2 h。TBST 稀釋 相應(yīng)一抗，孵育一抗，4 ℃過(guò)夜。37 ℃ 搖床孵二抗 2 h。洗 去多于二抗。將 ECL 試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶 溶液混勻，滴加于 PVDF 膜上，反應(yīng)，覆膜，X 光膠片壓片后 顯影，掃描膠片，用 BandScan 分析膠片灰度值。 2． 2． 4 ELISA 法檢測(cè) Aβ1 － 42的表達(dá) 于造模后 3 d 且未給 藥前與治療后分別檢測(cè) Aβ1 － 42 的含量。用預(yù)冷的 PBS 沖 洗組織，祛除殘留血液，稱重后剪碎，加入組織重量 9 倍的 預(yù)冷 PBS，用勻漿器充分勻漿，2500 r/min 離心 10 min，取上 清即組織勻漿液，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè) Aβ1 － 42的含量。

2． 3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用 SPSS 17． 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x 珋± s 表示，P ＜ 0. 05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。先對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)，再檢驗(yàn)方差齊性。若符合正態(tài)分布和方 差齊 性，采用單因素方差分析; 不符合則多組比較行 Kruskal － Wallis 秩和檢驗(yàn)，組間比較行 Nemenyi － Wilcoxon － Wilcox 秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3． 1 固本健腦法對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響

與正常組比較，假手術(shù)組逃避潛伏期無(wú)明顯變化( P ＞ 0. 05) 。與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)、穿 越平臺(tái)次數(shù)減少，學(xué)習(xí)記憶能力下降，差異有顯著性( P ＜ 0. 01) ; 經(jīng)藥物干預(yù)后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有所提升，與模型 組比較，各治療組逃避潛伏期均明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增 加，差異有顯著性( P ＜ 0. 05) ; 與西藥組比較，固中組逃避 潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，療效較西藥組佳，差異具 有顯著性( P ＜ 0. 05) 。見(jiàn)表 1。

4 討論

關(guān)于 AD 的發(fā)病機(jī)制，被廣泛接受的是 Aβ 級(jí)聯(lián)假說(shuō)， 這種假說(shuō)的的核心是淀粉樣前體蛋白( APP) 。APP 是一 種 110 – 130kDa 的 I 型跨膜蛋白，主要有 APP695 APP751 和 APP770三種異構(gòu)體，它們共享一段跨膜的肽段，胞外部分叫 做 Aβ 肽。生理情況下，APP 經(jīng)非淀粉樣途徑( Non － amyloidogenic processing) 由 α 內(nèi) 切 酶( α － secretase) 剪 切 成 sAPPα 和 CTFα，CTFα 再經(jīng) γ 內(nèi)切酶( γ － secretase) 切割成 P3 和 AICD ，具有營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。若進(jìn)入淀粉樣途 徑( Amyloidogenic processing) ，則 經(jīng) β 內(nèi) 切 酶( β － secretase) 剪 切 成 sAPPβ 和 CTFβ，CTFβ 再 經(jīng) γ 內(nèi) 切 酶( γ － secretase) 切割成 Aβ 和 AICD，產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性作用的 Aβ。因此，降低進(jìn)入淀粉樣蛋白途徑的 APP，是減少 Aβ 產(chǎn)生的重要方法。分揀蛋白相關(guān)受體 1 ( Sorting protein － related receptor with A － type repeats，SorL1，又稱 SorLA) 基因位于第 11 號(hào) 染色體上( 11q23． 2 － q24． 2) ，它所編碼的 SorLA 是一種 250KDa 的蛋白質(zhì)受體，屬于 Vps10p( vacuolar protein sorting defective，Vps) 受體蛋白家族一員。主要功能是在細(xì)胞 膜之間和細(xì)胞器官之間進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Vps10p 蛋白屬 于 Ι 型跨膜蛋白，其家族共有五個(gè)成員，還包括 sortilin、 SorCS1、SorCS2、SorCS3，他們共同的特征是在細(xì)胞膜外的 N 端都有一個(gè) Vps10p 跨膜結(jié)構(gòu)域。SorLA 與家族其他受體 蛋白的區(qū)別在擁有自己*的功能模塊，包括與 Vps10p 結(jié) 構(gòu)域順次連接的六翼 β 螺旋結(jié)構(gòu)( β － propeller) ，表皮生長(zhǎng) 因子前體型重復(fù)序列( EGF － type repeat) ，III 型纖連蛋白 結(jié)構(gòu)域( Fibronectin － type III domains) 與補(bǔ)體型重復(fù)序列 ( Complement － type repeats) 構(gòu)成的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。這種特殊的結(jié)構(gòu)決定了 SorLA 對(duì)蛋白質(zhì)具有分選 功能。SorLA 普遍存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元， 常見(jiàn)于大腦皮層的錐體細(xì)胞，海馬和小腦的浦肯野細(xì)胞。





 

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