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血液分子生物學檢驗技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、DNA測序技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因芯片（DNA-chip）技術(shù)等分子生物學技術(shù)。目前這些技術(shù)已應(yīng)用于血液病基因分析、基因診斷、白血病分型、指導治療、判斷預后和微小殘留病檢測等方面。

（1）核酸分子雜交技術(shù)原理和方法

1）Southern印跡雜交

2）Northern印跡雜交

3）核酸原位雜交

（2）聚合酶鏈反應(yīng)原理和常用PCR產(chǎn)物檢查方法

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)于1985年由美國Mullis等建立。PCR技術(shù)使體外擴增核酸片段成為可能，使人們能夠在幾小時內(nèi)從試管中獲得大量特異核酸片段。由于核酸是生物體儲存和傳遞遺傳信息的載體，因此能夠迅速獲得大量特異核酸片段的PCR技術(shù)給生命科學各個領(lǐng)域的研究手段帶來了革命性的變化。該技術(shù)已經(jīng)與DNA克隆、DNA重組和DNA測序等技術(shù)一樣成為血液分子生物學一項*的工具。
1）PCR產(chǎn)物檢測

①瓊脂糖凝膠電泳

②Southern印跡雜交

③斑點雜交法

④PCR-ELISA法

⑤原位雜交法

（3）以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)

近年來PCR技術(shù)在應(yīng)用的過程中得到了進一步的發(fā)展。目前已出現(xiàn)多種以PCR為基礎(chǔ)的PCR相關(guān)技術(shù)，形成了適用于不同目的的PCR技術(shù)系列，以下是幾種在血液學及檢驗領(lǐng)域應(yīng)用較多的PCR相關(guān)技術(shù)。

1）逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以細胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進行的體外擴增技術(shù)。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此必須先將總RNA或mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，生成與之互補的cDNA，然后再以cDNA作為模板進行PCR擴增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探針以及分析基因表達等。

2）定量PCR

zui初的PCR技術(shù)只是用于定性檢測DNA或RNA，對PCR產(chǎn)物的數(shù)量并不重視。隨著科學研究的逐步深入，人們開始考慮用PCR技術(shù)來進行DNA或RNA的定量檢測，隨之出現(xiàn)了定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技術(shù)這一新名詞。目前常用的Q-PCR技術(shù)可分為終點法和實時法。

3）多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）即在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，以同時擴增一份DNA樣品中多個不同序列的靶片段。多對引物間的組合必須滿足二個條件，一是將反應(yīng)條件較為接近的引物組合在一起，以使該反應(yīng)條件能盡量適合所有被擴增片段，二是同一反應(yīng)內(nèi)各擴增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測時能通過電泳將各片段分離開。多重PCR比較適用于被檢測基因較大，突變點較多的基因。

4）差異顯示PCR
差異顯示PCR（differential display PCR，DD-PCR）是一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達差異的技術(shù)?；蛟诓煌M織細胞中的表達不同，在細胞的不同發(fā)育階段和狀態(tài)中的表達也有差異。研究基因表達譜的變化有助于理解細胞分化、增殖、細胞周期的調(diào)節(jié)和細胞衰老、凋亡的過程。

5）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是指組織固定處理細胞內(nèi)的DNA或RNA，并以其作為靶序列進行PCR反應(yīng)的過程。原位PCR與普通PCR的主要區(qū)別在于模板的制備。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或細胞懸液均可作為擴增樣品，所有反應(yīng)在載玻片上進行。原位PCR技術(shù)不僅不需要從組織細胞中分離模板DNA或RNA，而且能在細胞原位進行PCR擴增，大大地提高了檢測的靈敏度。目前，原位PCR已成為研究靶基因序列的細胞定位、組織分布和基因表達檢測的重要手段。

（4）基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)又稱DNA微陣列（DNA - chip）。該技術(shù)是二十一世紀生命科學領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一項快速的分子生物學技術(shù)。DNA-chip是將大量以特定排列方式的基因探針或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，樣品DNA或RNA通過PCR擴增，體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標記分子，與微陣列雜交后再通過熒光掃描儀及計算機分析，即可獲得樣品大量基因序列及表達信息。目前，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用于白血病的免疫分型、細胞的基因表達檢測、基因異常檢測及單核苷酸多態(tài)分析等。

（5）分子生物學檢查在血液學中的應(yīng)用

1）惡性血液病融合基因的檢測

白血病染色體相互易位是導致染色體重排的zui常見原因。染色體重排在分子水平上常形成融合基因。重組產(chǎn)生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特異性分子標志。融合基因檢測對疾病的診斷、分型、治療方案的選擇、預后判斷及微小殘留病的檢測都有重要的意義。
慢性粒細胞白血病（CML）Ph 染色體易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表達一個具有高*激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)。
急性早幼粒細胞白血病（APL）特異性染色體易位是t（15；17）（q22；q21），易位的結(jié)果使15號染色體的PML原癌基因與17號染色體上的維甲酸受體a（RARa）基因融合產(chǎn)生PML-RARa融合基因。臨床上變異型APL（M3v，M3b）與急性粒細胞白血病部分分化型（M2）較難鑒別，M2的t（8；21）可產(chǎn)生一種融合基因AML1-ETO，這種融合基因在M2中的發(fā)生率為20％-40％，在M2b中可達90％，通過融合基因的檢測可準確鑒別這兩種白血病。融合基因的檢測對治療方案的選擇有明確的指導作用，在ATRA和*達*緩解（CR）的M3，PML-RARa融合基因陽性者極易在十個月內(nèi)復發(fā)，而融合基因陰性者，復發(fā)率低。

2）免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細胞受體（TCR）基因重排的檢測　IgH和TCR的編碼基因具有多態(tài)性。IgH基因重排是產(chǎn)生個體多樣性和*性的主要原因。由于白血病細胞源于造血干細胞，所以白血病細胞是單克隆性的。用PCR方法對重排基因進行擴增，正常白細胞的擴增產(chǎn)物大小不等，呈模糊的階梯狀，而白血病細胞擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后條帶是單一的。約80%的B淋巴細胞白血病可檢測到IgH基因重排。通過PCR方法檢測IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴細胞白血病的分型以及微量殘留的檢測。

3）遺傳性血液病的診斷　血紅蛋白病是常見的遺傳性溶血性疾病，血友病是常見的遺傳性出血性疾病?；蛉毕莅ɑ蛉笔?、點突變、插入、倒位等。對于基因重排，可通過RT-PCR進行檢測；對于點突變則可用PCR結(jié)合酶切位點分析，即當點突變使某一酶切位點消失或在某一區(qū)域出現(xiàn)新的酶切位點時，可用該酶切點兩側(cè)的引物進行擴增，然后將擴增產(chǎn)物用適當?shù)膬?nèi)切酶切割，根據(jù)電泳圖譜來判斷有無內(nèi)切酶切點的改變。對于與限制性內(nèi)切酶點無連鎖的點突變，則可采用PCR結(jié)合特異寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交法進行診斷。

4）HLA基因多態(tài)性檢測　采用PCR擴增產(chǎn)物的反相雜交（斑點雜交）進行HLA基因多態(tài)性檢測十分簡便、有效。將每個位點的所有寡核苷酸探針固定在固相支持物上，引物先經(jīng)*化后，進行待測DNA的基因擴增，從而得到*化的DNA放大產(chǎn)物。用此產(chǎn)物與膜上的探針雜交，然后進行顯色或化學發(fā)光。這樣每個樣本只需雜交一次即可完成。此方法適合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因與疾病相關(guān)性分析等。

5）腫瘤細胞多藥耐藥基因的檢測　多藥耐藥性（multidrug 　resistance,　MDR）是指腫瘤細胞接觸了一種藥物以后，不但對該藥產(chǎn)生耐藥性，而且對其他結(jié)構(gòu)的作用機制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，MDR的出現(xiàn)常與多藥耐藥基因（MDR1）過度表達有關(guān)，目前已建立Northern印跡法、斑點和狹縫印跡法、RT-PCR法及原位雜交法，從mRNA水平對患者進行測定，了解腫瘤細胞的耐藥特性。有研究表明，急性髓細胞白血病MDR1的表達與預后有密切相關(guān)，即MDR1陽性者CR率低，生存期短，且易早期復發(fā)。

6）基因治療　基因治療的目的是應(yīng)用DNA重組技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，把野生型的基因?qū)牖颊唧w細胞內(nèi)，成為正常的基因產(chǎn)物，來補償缺陷基因的功能，從而使疾病得到糾正。目前認為基因治療的靶細胞是造血干細胞或間質(zhì)干細胞等。常用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染血友病B患者的原代皮膚成纖維細胞，使其表達一定濃度的因子Ⅸ，這將為血友病B治療提供新的方法。