疫苗研發(fā)中佐劑粒度的分析

近日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院成功研發(fā)出*口服疫苗的消息登上熱搜，隨著*疫情的爆發(fā)，相關(guān)疫苗的新聞就頻頻刷屏，公眾一直期待著研制出有效的疫苗，助力戰(zhàn)勝*肺炎疫情，目前*已經(jīng)批復(fù)支持了5種疫苗的研發(fā)，包括滅活疫苗、減毒疫苗、核酸疫苗、載體疫苗和重組蛋白疫苗。這些疫苗的研發(fā)都在緊鑼密鼓地進(jìn)行中，作為疫苗中的重要組分，疫苗佐劑能提高機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答，能夠在免疫反應(yīng)低下的人群中誘導(dǎo)全面持久的免疫應(yīng)答，因此疫苗佐劑在疫苗中具有重要作用。

鋁佐劑

鋁佐劑是目前應(yīng)用較為廣泛的疫苗佐劑。疫苗用鋁佐劑主要有*、*和明礬 等，其中*應(yīng)用較多。*佐劑以4.5nm×2.2nm×10nm存在的纖維狀粒子，IEP為11.4，這種粒子聚集后以松散的1-10μm大小的形式存在。鋁佐劑的作用機(jī)理主要包括儲存庫效應(yīng)、免疫刺激效應(yīng)，鋁佐劑還可以通過活化Nlrp3炎性小體刺激先天免疫和誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18等。不過很多科研學(xué)者進(jìn)行的大量研究存在不同的試驗(yàn)結(jié)論，對于鉛鹽佐劑的作用機(jī)制，目前仍沒有統(tǒng)一、明確的結(jié)論，后續(xù)還需要大量的工作來探索這些作用機(jī)制。

鋁佐劑的顆粒大小及均一程度都會對疫苗的免疫效果造成影響。顆粒大小和吸附能力呈負(fù)相關(guān)，對傳統(tǒng)的氨水配置*佐劑的工藝改良，使佐劑的粒徑分布自517-950nm降至275-435nm，且均一性得到改善，發(fā)現(xiàn)其吸附能力得到較大提高。

另外不同的凍干工藝對鋁佐劑的聚集影響差異很大，而且聚集與它本身的濃度相關(guān)，一般隨著鋁鹽濃度的增加而增大。在常規(guī)凍干工藝中，如果存在大顆粒鋁鹽，小顆粒會更容易聚集成更多的大顆粒，這些聚集通過機(jī)械外力也很難逆轉(zhuǎn)，添加賦形劑或穩(wěn)定劑也很難有成效，失去提高疫苗免疫原性的價值。我們通過使用AccuSizer 780系列來進(jìn)行檢測，從而精準(zhǔn)測試鋁佐劑顆粒大小真實(shí)分布以及顆粒濃度參數(shù)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)粒度檢測中無法準(zhǔn)確檢測到大顆粒粒徑和含量難題。

納米化鋁佐劑

將鋁佐劑制備成納米顆粒后，由于其粒徑更小，比表面積急劇增大，具有表面反應(yīng)活性高，活性中心多，吸附能力強(qiáng)等特性，在相同鋁含量的情況下，可吸附更多的抗原。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)納米鋁佐劑制備的疫苗更易被地城細(xì)胞攝取，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，且炎性反應(yīng)較弱。但近年來研究也發(fā)現(xiàn)，納米材料在生物安全性和毒性方面存在一定的隱患，小于200nm的顆?？梢酝ㄟ^血腦屏障，納米金屬及其氧化物可對肝腎組織造成損害。我們通過使用Nicomp 380系列，可以獲得納米鋁佐劑的粒徑分布，同時通過*的Nicomp去卷積多峰分布，可以獲得粒徑組分的分布，幫助判斷是否存在更大或者過小的顆粒存在，從而避免納米鋁佐劑的因粒徑大小帶來的安全問題。

乳劑型佐劑和脂質(zhì)體佐劑

乳劑型佐劑也是臨床應(yīng)用較多的商品化佐劑，能有效提升抗體水平并延長抗體維持時間，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等在注射部位快速聚集和增值 ，增強(qiáng)對抗原的攝取和提呈，同時可以刺激多種細(xì)胞因子分泌形成免疫活化微環(huán)境。商品化的油乳佐劑以諾華公司的MF59為代表，諾華使用美國PSS粒度儀的粒度解決方案進(jìn)行顆粒分布、Zeta電位以及大顆粒檢測，尤其是通過分析大顆粒來進(jìn)一步改善佐劑的穩(wěn)定性。

脂質(zhì)體包裹目的抗原，發(fā)揮佐劑的作用。脂質(zhì)體疫苗與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，將蛋白質(zhì)遞送入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)入MHCⅠ類途徑，激活CD₈⁺T細(xì)胞。其作用機(jī)制與鋁佐劑相似，具有儲存庫效應(yīng)，并可以增強(qiáng)APC對抗原的攝入。在過去的20年里，開發(fā)了大量的以脂質(zhì)體為基礎(chǔ)佐劑的疫苗，目前已有商品化脂質(zhì)體佐劑上市。

聚合物微粒

可生物降解聚合物納微顆粒作為疫苗佐劑具有*的優(yōu)勢，己成為近年來的關(guān)注熱點(diǎn)，聚合物納微顆粒除了具有顆粒型佐劑共有的保護(hù)抗原免受酶解、抗原儲庫、APCs鞭向性、調(diào)節(jié)免疫提呈途徑、淋巴結(jié)靴向性等優(yōu)勢之外，還具有易于表面修飾、穩(wěn)定性好、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。常用于納微顆粒制備的聚合物材料可分為合成高分子材料和天然高分子材料，以PLGA微球?yàn)檩d體佐劑的HER-2多肽疫苗和HIV DNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

在過去的幾十年的時間里，學(xué)者們對鋁佐劑的作用機(jī)理開展了深入研究，同時也開發(fā)了大量的新型疫苗佐劑，除了上述提到的，還有免疫刺激復(fù)合物、病毒樣顆粒、細(xì)胞因子等等新型疫苗佐劑，其中有成功亦有失敗。每個佐劑的作用機(jī)制都非常復(fù)雜，體外研究很難破解。佐劑的安全性至關(guān)重要，因此，未來的工作重點(diǎn)之一應(yīng)是深入研究佐劑的作用機(jī)制，全面推測其對免疫系統(tǒng)的影響。

總結(jié)

粒徑是納微顆粒基本的屬性之一，顯著影響顆粒型疫苗佐劑的效果。粒徑可以通過影響納微穎粒與免疫細(xì)胞的相互作用以及顆粒向淋巴結(jié)的遷移效率等各個方面，終導(dǎo)致顆粒型疫苗效果差異。另外粒徑是影響細(xì)胞對顆粒攝取行為的一個重要因素，不同粒徑的顆粒以不同的途徑被抗原提呈細(xì)胞攝取。一般情況下，20-200nm顆粒以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取，而大于500nm的顆粒則以細(xì)胞飲和吞噬作用被細(xì)胞攝取。同樣顆粒粒徑也影響抗原提呈細(xì)胞的成熟速率。有研究表明，表面裝載了抗原的50nm聚苯乙烯顆粒被細(xì)胞攝取以后迅速進(jìn)入溶酶體，而500nm和3μm顆粒則在中性或弱酸性的吞噬體內(nèi)，并未進(jìn)入溶酶體。

表面電荷也是納微顆粒的另一個重要理化特性，對顆粒與免疫系統(tǒng)的相互作用具有重要影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，陽離子顆粒比陰離子顆粒更容易被抗原提成細(xì)胞攝取，因?yàn)榧?xì)胞膜表面為負(fù)電性，陽離子顆粒可以更有效結(jié)合到抗原提呈細(xì)胞表面，從而促進(jìn)吞噬作用發(fā)生。

盡管研究顆粒粒徑與其佐劑效應(yīng)關(guān)系的工作很多，但研究結(jié)論并不一致，出現(xiàn)原因可能是多方面的，比如顆粒與抗原種類不同，抗原與顆粒結(jié)合方式不同，免疫途徑和免疫程序不同等，除此之外，顆粒粒徑分布也是導(dǎo)致粒徑效應(yīng)研究結(jié)果不一致的原因之一。一般來講，粒徑分布較寬，尾端存在大顆粒會導(dǎo)致顆粒穩(wěn)定性較差，對于研究顆粒佐劑粒徑效應(yīng)工作而言，準(zhǔn)備真實(shí)的獲得粒徑分布情況時前提和關(guān)鍵因素。

PSS粒度儀的整套檢測方案，不僅可以檢測粒徑分布及Zeta電位，還能對尾端大顆粒進(jìn)行計數(shù)分析，獲得真實(shí)的粒徑分布范圍，從而保證研究中可以嚴(yán)格控制粒徑分布，保證結(jié)果可信度。另外對于質(zhì)量而言，可以分析批間差，確保每一批次的疫苗效果具有一致性。助力疫苗研發(fā)，愿*疫苗早日研發(fā)成功上市，戰(zhàn)勝病毒，祖國山河無恙,人間皆安。