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南京信帆生物:提高RT-PCR的靈敏度與產(chǎn)物長度

來源:南京信帆生物技術(shù)有限公司   2016年05月10日 20:35  

逆轉(zhuǎn)錄(RT)以及隨后進(jìn)行的PCR(RT-PCR)是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術(shù)之一。如果需要平行分析多個RNA 樣品,方法為一步法RT-PCR。如果要擴(kuò)增困難目標(biāo)片段或從單一cDNA 池中擴(kuò)增多重目標(biāo)片段則會選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)適用于各種RT-PCR 應(yīng)用。它含有一種全新的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外,RTplusPCR反應(yīng)緩沖液能夠自動調(diào)節(jié)鎂離子濃度,因此這一重要成分的濃度無需優(yōu)化。這種自我調(diào)節(jié)的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實(shí)現(xiàn)的。如果鎂離子濃度過高,螯合劑會與過剩的鎂離子結(jié)合,如果反應(yīng)(Taq 或DNA)需要鎂離子,鎂離子就會被釋放出來。這種創(chuàng)新技術(shù)提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進(jìn)行一步法,又能進(jìn)行兩步法RT-PCR,而且具有很大的動力學(xué)檢測范圍,能擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長度范圍也很大(一步法反應(yīng)zui長可擴(kuò)增5.3 kb片段;兩步法方案zui長能擴(kuò)增12.3 kb 片段)。

下面的實(shí)驗(yàn)可以展示該試劑盒在不同應(yīng)用中的表現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)1關(guān)注新試劑盒在一步法RT-PCR 中的靈敏度。而在一步法應(yīng)用中,zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標(biāo)材料進(jìn)行有效工作。

實(shí)驗(yàn)2顯示應(yīng)用一步法方案進(jìn)行長距離RT-PCR 不再是個難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時保證逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。

本系統(tǒng)提供的兩步法RT-PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實(shí)驗(yàn)3描述了對不同模板的擴(kuò)增情況。這個新的系統(tǒng)能為所有的RT目標(biāo)提供全面解決方案,不論需要擴(kuò)增的片段是中等長度還是極長,不同來源的總RNA 中轉(zhuǎn)錄本是低豐度還是高豐度。

 

材料和方法

 

Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進(jìn)行。

 

實(shí)驗(yàn)1:一步法靈敏度檢測RT-PCR 
擴(kuò)增目標(biāo):500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA:從人HELA細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案:Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng),標(biāo)準(zhǔn)一步法RT-PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液,鎂離子終濃度2.5 mM,反應(yīng)總體積50μl
循環(huán)參數(shù):

 

 

循環(huán)步驟溫度時間描述
1x150°C30分鐘逆轉(zhuǎn)錄
1x294°C3分鐘初始變性
40x {394°C15秒模版變性
468°C45秒引物退火/延伸

 


cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

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