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1、 菌株

用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。

2、溫度：
　在28度和室溫下誘導(dǎo)表達，表達水平可能都不低。

3、pH

手冊上用6.0，pH提高到6.8，不表達的蛋白可能就表達出來。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國內(nèi)外做的的rHSA，zui適pH大概5-6左右。pH3的時候yeast和peptone好像會沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。
 

4、偏愛密碼子

codon bias一般不是主要的問題，你要表達的蛋白特性才是主要問題，酵母對分子量大（30KD以上），結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達，尤其是分泌表達。密碼子改造對一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡單的蛋白表達量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達一個單鏈抗體，29KD，含有2對二硫鍵，表達量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達量沒有什么提高。

5、表達時間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對照

誘導(dǎo)時間長了以后，是會有很多蛋白分泌出來的，時間越長雜蛋白就越多，且分子量都比較大。做一個空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對照，這樣就會比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。

6、污染

每個樣品從G418板上挑10個左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃管，比LB管大一點），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導(dǎo)表達，3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會污染。加蓋報紙后，就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口，空氣浴搖床。

7、不表達

蛋白有沒有表達就要看你的運氣了，一般重復(fù)2－3次實驗都沒有表達菌株，這個蛋白就放棄表達了。

8、表達量

30KD,10mg/L表達量已經(jīng)很高，zui直接的方法是發(fā)酵，一般提高5－10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團的超表達蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表達的N糖基化是可以預(yù)測的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點，X為任意氨基酸，1個糖基化位點會加上1－3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無法預(yù)測其位點，不過很少聽說表達蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達，不存在糖基化的問題。

10、表型與表達

重組SalI和BglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇誘導(dǎo)表達時生長快，消耗的甲醇多，后者生長慢，消耗的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達時Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對某些蛋白Muts菌株可能表達的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達較好。

11、培養(yǎng)基

YPD：zui基本的培養(yǎng)用；BMGY：誘導(dǎo)表達前培養(yǎng)用；BMMY：誘導(dǎo)表達用；MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導(dǎo)表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、*。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。

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