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用反義RNA分子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到的困難是反應(yīng)模板的穩(wěn)定性差。因此，人們正在探索如何改進(jìn)反義基因的新方法，目前主要有：

（1）優(yōu)化反義RNA的結(jié)合。反義RNA鏈的長度對(duì)抑制基因的效果是重要的。雙螺旋形成過程中將釋放能量，RNA鏈越長，釋放的自由能越多。從這一意義來講，可以說長RNA作為反義RNA更有效。但是，并沒有關(guān)于反義RNA長度的一般規(guī)則。 Nellen和Lichtentein曾指出，有關(guān)反義RNA技術(shù)的一個(gè)普遍問題是，怎樣使反義RNA更有效，即怎么樣使一個(gè)互補(bǔ)的RNA成為有效的反義 RNA。在植物中覆蓋整個(gè)cDNA的反義RNA有效地抑制了基因表達(dá)。但是，與5¹或3¹端部分mRNA互補(bǔ)的反義RNA效果同樣好。zui小的反義RNA只有41個(gè)核苷酸。

反義RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)雙螺旋的形成至關(guān)重要。因?yàn)樾纬呻p鏈結(jié)構(gòu)必須克服正義和反義RNA本身的二級(jí)結(jié)構(gòu)，比潛在自由能的量更重要的是形成雙螺旋的作用能量，也就是說，雙螺旋構(gòu)象是由動(dòng)力學(xué)控制的，而不是由釋放的自由能的量控制的。原核生物中自然發(fā)生的RNA可以很好的說明RNA結(jié)構(gòu)與形成雙螺旋構(gòu)象的速度之間的復(fù)雜關(guān)系。Simons和Kleckner指出，許多非常有效的反義RNA 通常較短（約70個(gè)核苷酸），含有一個(gè)典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如大腸桿菌R1質(zhì)粒的拷貝數(shù)受反義 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者詳細(xì)研究了這一系統(tǒng)，其正義和反義RNA由同一DNA編碼，但以相反方向轉(zhuǎn)錄。因此，點(diǎn)突變一點(diǎn)也不能改變這兩種 RNA的互補(bǔ)性，但是當(dāng)同時(shí)改變正義和反義RNA環(huán)區(qū)時(shí)，雖然兩條RNA鏈*互補(bǔ)，但結(jié)合率下降了三至四倍。與此同時(shí)，質(zhì)粒拷貝數(shù)卻增加了。很顯然，結(jié)合率受正義和反義RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。兩條RNA鏈形成雙螺旋的初始“吻合”結(jié)構(gòu)非常重要。

毫無疑問，內(nèi)源的正義RNA不能被改變，但反義RNA的靶結(jié)合區(qū)及反義RNA的長度是可以改變的。這將影響反義RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而改變其結(jié)合能力，使其與靶RNA結(jié)合更有效。Rittner等令人信服地證明了反義RNA的長度與它的結(jié)合率之間的復(fù)雜關(guān)系。他們用一個(gè)5¹端長度固定的人免疫缺陷型I型病毒（HIV-I）的反義RNA，改變其3¹端，從而改變了RNA長度。然后選擇能夠快速結(jié)合的反義RNA，發(fā)現(xiàn)結(jié)合率長度之間的關(guān)系依長度和相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同而擺動(dòng)。3¹端只有幾個(gè)核苷酸不同的反義RNA結(jié)合率變化可達(dá)上百倍。這與反義RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。而且，體外的結(jié)合率與體內(nèi)抑制HIV-I增值的有效性一致。這些結(jié)果也證明了在體內(nèi)應(yīng)用反義RNA抑制靶基因之前，在離體條件下實(shí)驗(yàn)的重要性。

在優(yōu)化反義RNA的實(shí)際長度以前，也可以用計(jì)算機(jī)輔助分析靶RNA，以尋找有效的靶RNA序列，通過設(shè)置一個(gè)50~400核苷酸的窗口，Sczakiel等設(shè)計(jì)了基因組和非基因組HIV RNA的能量。這些能量反映了區(qū)域折疊能力。觀察到高△G值（低自由能）區(qū)域與抑制HIV復(fù)制的zui有效區(qū)相對(duì)應(yīng)。

（2）延長反義RNA的半衰期。原核生物中自然發(fā)生的反義RNA極其穩(wěn)定，可能是由于它們特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)保護(hù)它們免受核酸外切酶的降解。據(jù)報(bào)道，通過控制插入序列IS10的RNA-OUT，能在體內(nèi)穩(wěn)定存在70 min，達(dá)三代之久。在反義RNA的末端加上這些保護(hù)性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可以減少核酸外切酶的降解。Heinrich等應(yīng)用了這一方法。zui近，Bourque 和Folk報(bào)道，一個(gè)變相方法是把反義RNA與tRNA連接，用一個(gè)依賴于DNA的RNA聚合酶III特異啟動(dòng)子來表達(dá)。

（3）在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)反義RNA。另一個(gè)能夠獲得高水平表達(dá)的反義RNA的方法是在一個(gè)游離的復(fù)制系統(tǒng)中表達(dá)反義基因。這種系統(tǒng)不同于轉(zhuǎn)基因于細(xì)胞核內(nèi)染色體上。已有幾個(gè)應(yīng)用植物RNA病毒作為載體的系統(tǒng)，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)反義RNA。Joshi等用螢火蟲螢光素酶基因代替了大麥條斑病毒（BSMV）RNA β的開放讀碼框b，并且在轉(zhuǎn)染煙草和玉米原生質(zhì)體時(shí)表達(dá)；Donson等用一個(gè)以TMV為基礎(chǔ)的載體來產(chǎn)生細(xì)菌*磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT II）。Chapman等應(yīng)用馬鈴薯病毒X（PVX）為載體，表達(dá)了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）。Dolja等把GUS插入到煙草蝕刻病毒（TEV）的多聚蛋白中，得到了表達(dá)。因此，在這樣的系統(tǒng)中表達(dá)反義RNA是*可行的。劉博林等借助于Chapman等的PVX載體表達(dá)系統(tǒng)，在野生煙草（N. clevelandii）細(xì)胞質(zhì)中成功表達(dá)了對(duì)應(yīng)于plum pox virus（PPV）的反義RNA和酶性RNA。這為在細(xì)胞質(zhì)中抑制RNA病毒的復(fù)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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