Lenti-CMV-CD9-EGFP（外泌體示蹤用），即Lentivirus expressing CD9-EGFP fusion protein，是碧云天自行研發(fā)的一種可以在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括原代細(xì)胞和干細(xì)胞)中通過CMV啟動(dòng)子表達(dá)人源CD9-EGFP融合蛋白的重組慢病毒。本產(chǎn)品可用于外泌體的示蹤研究，用于研究外泌體的形成、分泌、靶向和運(yùn)輸機(jī)制。本產(chǎn)品帶有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，感染細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株。

外泌體(Exosome)是膜包裹的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，天然存在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中[1]，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體[2]。如圖1所示，細(xì)胞膜內(nèi)吞(Endocytosis)依次形成初級(jí)內(nèi)體(Early sorting endosome, ESE)、次級(jí)內(nèi)體(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡體(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡體包含腔內(nèi)囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體，外泌體攜帶多種來自其母體細(xì)胞的成分(包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類和代謝物等)釋放到胞外基質(zhì)中[3]。外泌體可以被附近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞識(shí)別和融合，是細(xì)胞間進(jìn)行相互調(diào)控的重要媒介，參與了癌癥、神經(jīng)退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發(fā)病過程，影響細(xì)胞多方面的功能[4-5]。

圖1. 外泌體的形成原理及其攜帶的母體細(xì)胞成分示意圖。

外泌體標(biāo)志蛋白(Protein biomarkers for exosome)，也稱外泌體蛋白標(biāo)志物(Protein markers for exosome)，可以用于鑒定、觀察、標(biāo)記和純化外泌體。據(jù)外泌體據(jù)庫統(tǒng)計(jì)來自不同生物、細(xì)胞類型和體液的外泌體中已發(fā)現(xiàn)9769種蛋白質(zhì)，ExoCarta列出了100種常見外泌體蛋白標(biāo)志物，其中CD9、CD63、CD81、Alix、Flotillin、Ceramide和Tumor susceptibility gene 101 (TSG101)是常用的外泌體蛋白標(biāo)志物(如圖2所示[3])。CD9在人體中由CD9基因編碼的蛋白質(zhì)抗原，是跨膜四超家族(Transmembrane 4 superfamily)成員之一，為4次跨膜蛋白，大量存在于細(xì)胞外囊泡的表面，也會(huì)出現(xiàn)在普通的細(xì)胞膜表面。CD9是常用的外泌體蛋白標(biāo)志物之一，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移，同時(shí)還可以觸發(fā)血小板活化和聚集，被認(rèn)為是血小板活化標(biāo)志物[6]。

圖2. 常見的外泌體蛋白標(biāo)志物示意圖。

Lenti-CMV-CD9-EGFP感染HEK293T細(xì)胞后的表達(dá)效果如圖3所示。

圖3. 碧云天生產(chǎn)的Lenti-CMV-CD9-EGFP (C4007)感染HEK293T細(xì)胞的效果圖。96孔板每孔10,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后用相應(yīng)的病毒TU數(shù)進(jìn)行感染，病毒感染72小時(shí)后熒光顯微鏡實(shí)拍相同大小視野效果圖。實(shí)際檢測效果會(huì)因檢測儀器、實(shí)驗(yàn)條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。

慢病毒感染細(xì)胞后會(huì)將目的基因隨機(jī)整合到基因組DNA上，因而可以長期穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白，并且?guī)缀蹩梢愿腥舅胁溉閯?dòng)物細(xì)胞，在很多不分裂的細(xì)胞中也可以長期穩(wěn)定表達(dá)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

本產(chǎn)品表達(dá)嘌呤霉素抗性基因，因此本產(chǎn)品感染培養(yǎng)的細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株以用于后續(xù)研究。

碧云天的Lenti-CMV-CD9-EGFP是復(fù)制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增強(qiáng)子功能發(fā)生缺失，形成了自失活(Self-inactivating) 3' LTR，并且5' LRT中的U3區(qū)域替換成CMV啟動(dòng)子，在感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，從而有效降低了本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。

碧云天推薦的慢病毒感染不同種類體外培養(yǎng)細(xì)胞的MOI值參見下表。

實(shí)驗(yàn)室常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相關(guān)病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之間的比較和差別參見下表。具體的特定病毒的一些特征和下表相比可能會(huì)有一定差異。

本產(chǎn)品的滴度不低于10^9TU/ml，適合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。TU, transduction unit，即轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。TU通過本產(chǎn)品梯度稀釋后感染HEK293T細(xì)胞后測定獲得，能讓一個(gè)HEK293T細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光的活力單位定義為1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量的比值。使用10^9TU/ml的本產(chǎn)品，如果按照5 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計(jì)算，100μl共可以感染40個(gè)孔；如果按照5 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬細(xì)胞計(jì)算，100μl共可以感染200個(gè)孔。如果MOI值提高，相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)減少；如果MOI值下調(diào)，相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)增加。

-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2個(gè)月內(nèi)有效。4℃保存，一周內(nèi)有效。

反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度，如有必要請(qǐng)?jiān)谑盏奖井a(chǎn)品后分裝保存。分裝時(shí)必須在冰浴上進(jìn)行。病毒融解后，如果在一周內(nèi)使用，可以放于4℃，但須注意4℃存放時(shí)間越長，滴度下降越明顯。如果-80℃保存時(shí)間超過一年，可能會(huì)導(dǎo)致滴度下降，此時(shí)建議重新測定病毒滴度。

本產(chǎn)品使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀附錄1《慢病毒使用安全規(guī)范》。本產(chǎn)品生物安全等級(jí)為Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常規(guī)的微生物實(shí)驗(yàn)操作要求進(jìn)行操作(Standard microbiological practices)的基礎(chǔ)上，還需要注意限制接觸、生物危害提示、顯著的警示標(biāo)識(shí)、并制定相應(yīng)的安全規(guī)范。

病毒操作中應(yīng)注意有效防護(hù)，絕對(duì)禁止在生物安全柜內(nèi)有任何皮膚直接暴露的情況。實(shí)驗(yàn)完成后，請(qǐng)及時(shí)清洗雙手。嚴(yán)禁直接接觸病毒，如意外接觸，請(qǐng)及時(shí)用清水沖洗，并適當(dāng)用70%乙醇對(duì)皮膚進(jìn)行消毒。

任何接觸過病毒的材料、試劑、樣品，應(yīng)經(jīng)消毒處理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分鐘以上，或121℃高壓滅菌30分鐘。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

Lenti-CMV-CD9-EGFP（外泌體示蹤用）