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近年來(lái),隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,蛋白提取純化技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的一部分。蛋白提取純化是一項(xiàng)復(fù)雜的技術(shù),對(duì)于許多研究人員來(lái)說(shuō),它已經(jīng)成為一項(xiàng)難題。本文將介紹一些有關(guān)于蛋白提取純化注意事項(xiàng),幫助研究人員更好地掌握此項(xiàng)技術(shù),提高蛋白質(zhì)的質(zhì)量和應(yīng)用效果。
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的細(xì)胞系,如人胚肺細(xì)胞、大鼠肝細(xì)胞等。
2. 試劑和儀器:蛋白酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠、轉(zhuǎn)膜儀等。
二、實(shí)驗(yàn)原理
蛋白提取純化是生物化學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)重要的技術(shù),通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的提取和純化,可以對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、生物學(xué)功能以及蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)主要采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取總蛋白,并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì),利用轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上,最后用Western blot方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞培養(yǎng):將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在37℃下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合度時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2. 細(xì)胞裂解:用PBS洗滌細(xì)胞,加入適量RIPA裂解液,用細(xì)胞刮棒將細(xì)胞刮破,然后移入離心管中,4℃下12000rpm離心10分鐘。
3. BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度:取上清液,加入BCA工作液,常溫下放置20分鐘,用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值,計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
4. SDS-PAGE凝膠電泳:根據(jù)蛋白質(zhì)濃度配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE凝膠,將樣品加入凝膠孔中,進(jìn)行電泳分離。
5. 轉(zhuǎn)膜:將凝膠上的目的蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到膜上。
6. Western blot:用膜封閉液封閉膜,加入一抗和二抗,然后用化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影。
總之,蛋白提取純化是一項(xiàng)較為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù),需要注意的細(xì)節(jié)較多。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)原理和操作規(guī)程,避免出現(xiàn)誤差或錯(cuò)誤的情況。同時(shí)要保持無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境,注意試劑的質(zhì)量和保存方式,以及在Western blot檢測(cè)時(shí)合理調(diào)整抗體濃度和曝光時(shí)間等因素。
以上就是有關(guān)于蛋白提取純化注意事項(xiàng)的全部?jī)?nèi)容,如果你想了解更多,請(qǐng)給百奧創(chuàng)新留言哦~
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