1.1.1 細(xì)胞株

細(xì)胞凋亡檢測*耐受的肺腺癌A549細(xì)胞株 (A549-DDP)由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬*醫(yī)院邱峰教授惠贈, A549-DDP是在人肺腺癌細(xì)胞A549的基礎(chǔ)上, 以*作為誘導(dǎo)藥物, 采用逐步遞增濃度的方法誘導(dǎo)獲得, 在常規(guī)培養(yǎng)中使用2 μg/mL的*維持其耐藥性狀。

1.1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基與新鮮小牛血清購自美國Gbico公司, *、MTT購自美國Sigma 公司, RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqDNA 聚合酶購自TaKaRa公司, RASSF1A表達(dá)質(zhì)粒購自美國Addgene公司, 轉(zhuǎn)染試劑(X-TremeGENEHp DNATransfection Regent)購自美國Roche公司, 質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega公司, RASSF1A一抗購自 Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 RASSF1A表達(dá)質(zhì)粒的提取

添加5 mL LB培養(yǎng)基于無菌的玻璃試管, 用接種環(huán)挑取含有RASSF1A表達(dá)質(zhì)粒的DH5α菌液于準(zhǔn)備好的LB培養(yǎng)基中, 200 r/min, 37 °C搖菌12~16 h, 按質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行提取細(xì)菌質(zhì)粒, 分光光度計(jì)檢測RASSF1A 表達(dá)質(zhì)粒濃度和純度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和RASSF1A表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549- DDP細(xì)胞

用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A549-DDP細(xì)胞(培養(yǎng)基加入2 μg/mL*以維持A549-DDP細(xì)胞的耐藥性狀), 37 °C、5% CO2 條件下培養(yǎng)24 h, 0.25%*消化貼壁A549-DDP細(xì)胞, 新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基中和*并收集細(xì)胞懸液, 離心棄上清, RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù), 按照每孔2×105 細(xì)胞鋪6孔板, 37 °C、5% CO2培養(yǎng)24 h; 選擇對數(shù)生*的A549-DDP細(xì)胞株, 常規(guī)細(xì)胞換液, 嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將2 μL轉(zhuǎn)染試劑+1 μg DNA分別轉(zhuǎn)染PCMV5-RASSF1A表達(dá)質(zhì)粒和PCMV5空載體, 37 °C、5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.2.3 RNA提取和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后RASSF1A mRNA水平

參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物, 其中GAPDH為內(nèi)參基因。Trizol法提取各組的總RNA, 分光光度法檢測RNA濃度。取400 ng總RNA用RT反應(yīng)液合成*條cDNA序列, 然后按照PCR反應(yīng), 條件如下: 95 °C 預(yù)變性, 5 min; 94 °C變性, 30 s, 60 °C退火, 30 s, 72 °C 延伸30 s, 共35個循環(huán)。GAPDH以相同條件反應(yīng)35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳20 min。

1.2.4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后RASSF1A蛋白表達(dá)情況

用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩遍, 加入40 μL RIPA, 4 °C, 12 000 r/min, 離心10 min。BCA試劑盒檢測蛋白濃度, 將細(xì)胞總蛋白和6×上樣緩沖液混勻, 100 °C, 5 min使蛋白變性, 進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 條件: 先80 V, 30 min; 后為100 V, 100 min。然后將聚丙烯胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 轉(zhuǎn)膜條件: 100 V, 90 min。將PVDF膜用含5% BSA的PBST封閉1 h, 一抗(1:500) 4 °C孵育過夜, 0.1%的TPBS洗3次, 用HRP標(biāo)記的二抗(1:1 000)在4 °C條件下孵育1 h, 0.1%的TPBS洗3 次, 用ECL試劑盒顯色并在BIO-RAD成像儀上成像。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞活力并計(jì)算IC50

選擇轉(zhuǎn)染后的A549-DDP細(xì)胞, 按照4 000/孔的初始細(xì)胞密度鋪96孔板, 每個濃度設(shè)5個平行孔, 培養(yǎng)24 h, 給予不同濃度*, *濃度如下: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μmol/L。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至20 h時, 每孔加入5 mg/mL的MTT試劑, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液, 每孔加入150 μL DMSO, 搖床搖10 min, 然后在490 nm處比色, 計(jì)算IC50。

1.2.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

選擇轉(zhuǎn)染后的A549- DDP細(xì)胞, 按照10 000/孔的初始細(xì)胞密度鋪12孔板, 培養(yǎng)24 h給藥, 給藥濃度如下: 0, 20, 100 μmol/L。連續(xù)培養(yǎng)5天, 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液, 用PBS洗滌2次, 然后用甲醇固定15 min, 棄去甲醇并用流水輕輕沖洗兩次, 結(jié)晶紫染色5 min, 用流水輕輕沖去染液。自然干燥后計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

選擇轉(zhuǎn)染后的A549-DDP細(xì)胞, 按照每孔200 000/孔的初始細(xì)胞密度鋪6孔板, 培養(yǎng)24 h后, 20 μmol/L*給藥, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 收集細(xì)胞, 用冷的PBS洗滌細(xì)胞3次, 2 000 r/min, 離心5 min, 收集細(xì)胞。

加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞并加入 5 μL Annexin V-EGFP混勻后, 加入5 μL Propidium Iodide, 混勻; 室溫、避光、反應(yīng)15 min后, 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況(早期凋亡與晚期細(xì)胞凋亡檢測之和)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x _ ±s表示, 不同實(shí)驗(yàn)組之間的比較用F檢驗(yàn), 所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均在統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0上進(jìn)行, P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
對照品    含量測定    *    100012-200105        100mg
對照品    含量測定    *磷酸鈉    100016-20011A        100mg
對照品    含量測定    氨苯甲酸    100017-200308        50mg
對照品    檢查    *    100018-200408        1000mg
對照品    鑒別    *    100021-198102        200mg
對照品    HPLC法含量測定    *（曾用名：甘羅溴銨）    100022-200403        100mg
對照品    鑒別    *    100023-198601        50mg
細(xì)胞凋亡檢測