使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽性對照。
參數(shù)規(guī)格：

產(chǎn)品名稱：轉(zhuǎn)基因品系大豆A2704-21染料法qPCR試劑盒
貨號:CP96950
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
運(yùn)輸：低溫
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

PCR檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
?實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

以下是轉(zhuǎn)基因品系大豆A2704-21染料法qPCR試劑盒公司正在熱銷的產(chǎn)品：
Human SYP(Synaptophysin) ELISA Kit資源名稱泛菌種屬:Pantoea│sp.分離基物:市售水產(chǎn)體表

Human BST1(ADP-ribosyl cyclase 2) ELISA Kit資源名稱氣微菌種屬:Aeromicrobium│sp.分離基物:土壤

Human PIICP(C-terminal propeptide of Collagen alpha-1(II)chain) ELISA Kit資源名稱茄科雷爾氏菌種屬:Ralstonia solanacearum分離基物:辣椒

Human PIINP(N-terminal propeptide of Collagen alpha-1(II)chain) ELISA Kit資源名稱馬鏈球菌獸瘟亞種(馬鏈球菌動物傳染病亞種)種屬:Streptococcus│equi subsp. Zooepidemicus分離基物:土壤

Human DCP(Des-gamma carboxyprothrombin) ELISA Kit資源名稱冷解糖芽孢桿菌種屬:Bacillus│psychrosaccharolyticus分離基物:土壤樣品

Human WNT3A(Protein Wnt-3a) ELISA Kit資源名稱食瓊脂類芽孢桿菌種屬:Paenibacillus│agaridevorans分離基物:土壤樣品

Human SMAD2(Mothers against decapentaplegic homolog 2) ELISA Kit資源名稱埃特*瘤菌種屬:Rhizobium│etli分離基物:土壤樣品

Human Smad3/MADH3(Mothers Against Decapentaplegic Homolog 3) ELISA Kit資源名稱金黑小單胞菌種屬:Micromonospora│auratinigra分離基物:土壤樣品

Human PPRC1(Peroxisome prolifeRator-activated receptor gamma coactivator-related protein 1) ELISA Kit資源名稱苜蓿中華根瘤菌種屬:Sinorhizobium meliloti提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human CD24(Signal transducer CD24) ELISA Kit資源名稱木糖氧化產(chǎn)堿桿菌種屬:Alcaligenes│xylosoxidans分離基物:醫(yī)療用品

Human RPESP(RPE-spondin) ELISA Kit資源名稱沙地芽孢桿菌種屬:Bacillus│aquimaris分離基物:土壤

Human SEMA3G(Semaphorin-3G) ELISA Kit資源名稱解酪蛋白巨大球菌種屬:Macrococcus│caseolyticus分離基物:土壤

Human ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B) ELISA Kit資源名稱遲鈍愛得華氏菌種屬:Edwardsiella│tarda分離基物:短鰭紅娘魚腸胃道

Human ZG16(Zymogen granule membrane protein 16) ELISA Kit資源名稱脫色希瓦氏菌種屬:Shewanella│decolorationis分離基物:草魚腸胃道

Human LDHA(L-lactate dehydrogenase A chain) ELISA Kit資源名稱格氏沙雷菌種屬:Serratia│grimesii分離基物:草魚腸胃道

Human LDHC(L-lactate dehydrogenase C chain) ELISA Kit資源名稱志賀氏菌種屬:Shigella│sp.分離基物:短鰭紅娘魚腸胃道

Human UCN(Urocortin) ELISA Kit資源名稱玫瑰色庫克菌種屬:Kocuria│rosea分離基物:短鰭紅娘魚腸胃道

Human SOD3(Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn]) ELISA Kit資源名稱黃色短波單胞菌種屬:Brevundimonas│aurantiaca分離基物:草魚腸胃道

Human GP6(Platelet glycoprotein VI) ELISA Kit資源名稱類產(chǎn)堿假單胞菌種屬:Pseudomonas│pseudoalcaligenes分離基物:土壤

Human LPCAT3(Lysophospholipid acyltransferase 5) ELISA Kit資源名稱黑座克雷伯氏菌種屬:Klebsiella│variicola分離基物:草魚腸胃道
轉(zhuǎn)基因品系大豆A2704-21染料法qPCR試劑盒MT1E(Metallothionein-1E)|MT-1E形態(tài)特性  上皮細(xì)胞樣生長特性 松散貼壁特征特性  該細(xì)胞1976年建系，源自一位48歲患有癌女性的胸腔積液，但近來有研究證明該細(xì)胞被M14黑色素瘤細(xì)胞污染。 培養(yǎng)條件  L15: Leibovitz Medium  10% FBS

PLD2(Phospholipase D2)|Phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipase D2|Choline phosphatase 2|PLD1C|hPLD2形態(tài)特性  多角形生長特性 貼壁生長特征特性  該細(xì)胞源于一名43歲患有腺癌女性的胸腔積液。 培養(yǎng)條件  L15: Leibovitz Medium  10% FBS；10 mcg/ml insulin, 16 mcg/ml glutathione

GPT2|AAT2(Alanine aminotransferase 2)|ALT2|Glutamic--pyruvic transaminase 2|Glutamate pyruvate transaminase 2(GPT 2)|Glutamic--alanine transaminase 2形態(tài)特性  上皮細(xì)胞樣生長特性 貼壁生長特征特性  該細(xì)胞1987年建系，源自一位54歲患有非小細(xì)胞肺癌的白人男性，該患者為吸煙者。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS

SERPINH1(Serpin H1)|PIG14|CBP1|CBP2|HSP47|SERPINH2|Rheumatoid arthritis-related antigen RA-A47|Collagen-binding protein(Colligin)|Cell proliferation-inducing gene 14 protein|47 kDa heat shock protein|Arsenic-transactivated protein 3(AsTP3)形態(tài)特性  上皮細(xì)胞樣生長特性 貼壁生長特征特性  該細(xì)胞1989年建系，源自一位患有肺鱗狀細(xì)胞癌的男性，該患者不吸煙。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS

CTSK(Cathepsin K)|CTSO|CTS02|Cathepsin X|Cathepsin O|Cathepsin O2形態(tài)特性  上皮細(xì)胞樣生長特性 貼壁生長特征特性  該細(xì)胞1982年由A.F. Gazdar建系，源自一位患有大細(xì)胞肺癌的男性的胸腔積液。該細(xì)胞角蛋白、波形蛋白陽性。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS

ITGAV(Integrin alpha-V)|CD51|MSK8|Vitronectin Receptor alpha|VNRA|antigen identified by monoclonal L230|CD51 antigen||integrin|alpha V(vitronectin receptor|alpha polypeptide|antigen CD51)|Vitronectin receptor subunit alpha|形態(tài)特性  圓形生長特性 懸浮生長特征特性  該細(xì)胞1982年建系，源自非小細(xì)胞肺癌男性患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS

DEFB103A(Beta-defensin 103)|DEFB3|BD14|BD3|DEFB103B|HBD-3|BD-3|Beta-defensin 3|DEFB103|DEFB-3|DEFB3DEFB103A|Defensin|beta 103|defensin|beta 103B|Defensin-like protein|hBD-3|HBD3HBP3形態(tài)特性  聚團(tuán)懸浮生長特性 懸浮生長，聚團(tuán)特征特性  該細(xì)胞源自一位54歲患有小細(xì)胞肺癌的白人男性，表達(dá)c-myb, v-fes, v-fms, c-raf 1, Ha-ras, Ki-ras and N-ras mRNA。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS

KLK2(Kallikrein-2)|Glandular kallikrein-1(hGK-1)|Tissue kallikrein-2形態(tài)特性  淋巴母細(xì)胞樣生長特性 懸浮生長特征特性  該細(xì)胞源自一位62歲患有骨髓瘤男性的胸腔積液，PCA-1、CD38陽性，EBNA陰性。 培養(yǎng)條件  RPMI 1640 (w/o Hepes)  10% FBS；0.05 Mm2-巰