細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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商品介紹：

使用方法：

收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

培養(yǎng)操作：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

100g RNPVP K30 (聚乙烯咯烷酮K30)   常溫

2 ug pEBFP-N1 pEBFP-N1 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

CDC厭氧菌瓊脂 CDC Anaerobic Agar 250g

25g 葡聚糖凝膠 LH-20 Sephadex LH-20  室溫保存

50T 小反芻獸疫病毒PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

200 mL 大鼠胰島細(xì)胞分離液1.063 Cell Separation Solution -20℃保存

250mL Glycine Buffer（緩沖液）,0.2M,

大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞BL瓊脂培養(yǎng)基 英文名稱：BL Agar Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(sPECAM-1/sCD31)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

BBL瓊脂培養(yǎng)基 英文名稱：BBL Agar Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

TPY瓊脂培養(yǎng)基 英文名稱：TPY Agar Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

PYG液體培養(yǎng)基基礎(chǔ) 英文名稱：PYG Broth Medium Base 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)免疫試劑盒*直銷

APT肉湯 英文名稱：APT Broth 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性瘦素受體(sLR)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 英文名稱：Lactobacillus broth Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(sLOX-1)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

MRS肉湯 英文名稱：MRS Broth 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性肌球蛋白重鏈2(sMHC-2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

雙歧桿菌BS培養(yǎng)基 英文名稱：Bifidobacterium BS Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠可溶性肌球蛋白重鏈1(sMHC-1)免疫試劑盒*直銷

氯化血紅素 英文名稱：hemin 產(chǎn)品規(guī)格：1g 小鼠可溶性核因子κB受體活化因子配基(sRANKL)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

K1 英文名稱：vitamin K1 產(chǎn)品規(guī)格：1g 小鼠可溶性補(bǔ)體激活產(chǎn)物SC5b9 免疫試劑盒進(jìn)口、分裝