牛呼吸道合胞體病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

    1.   特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過(guò)詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過(guò)GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測(cè)，特異性均達(dá)到100%。

    2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)菌株的驗(yàn)證，重現(xiàn)性為100%。

    3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)菌的高靈敏檢測(cè)，當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其的直接檢測(cè)，無(wú)需繁瑣的增菌過(guò)程。

    4.   實(shí)用性：檢測(cè)范圍廣，涵蓋了對(duì)人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程為3-4個(gè)小時(shí)。

    5.   優(yōu)勢(shì)1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外，公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(yōu)勢(shì)2：該系列試劑盒均經(jīng)過(guò)大量的保守性及特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，憑借公司擁有的豐富的菌種資源，每一種檢測(cè)試劑盒均經(jīng)過(guò)了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗(yàn)證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗(yàn)證，確保在使用過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)任何的假陽(yáng)性及假陰性報(bào)告結(jié)果。

PCR使用方法：

一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

2. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作： 

3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個(gè)樣品）為例：在一干凈塑料

管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nèi)用完，不要長(zhǎng)期放置。一次檢測(cè)一個(gè)樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個(gè)樣品。如果待測(cè)樣品數(shù)量為其他數(shù)字，

配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。

4. 在標(biāo)記好的 N+2 個(gè)離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液體樣品（如牛奶）待測(cè)樣品。在樣品制備陽(yáng)性對(duì)照中加入 5uL 陽(yáng)性對(duì)照，在樣品制備陰性對(duì)照中加入 5uL 水。

5. 在每個(gè)管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

6. 95℃保溫 10 分鐘。

7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個(gè)樣品得到的 DNA釋放液足夠進(jìn)行 50-100 次 PCR。

實(shí)驗(yàn)規(guī)則：

1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過(guò)2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但有專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。

3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。

4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。

6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。

9、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

10、對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。

PCR反應(yīng)流程常規(guī)程序

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴(kuò)增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應(yīng)時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級(jí)時(shí)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*。

5．PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

對(duì)于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì)擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應(yīng)成分分開(kāi)配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。

按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會(huì)混合在一起。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱(chēng)和ID號(hào)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

試劑使用須知：

（1）請(qǐng)參照相關(guān)法規(guī)、文獻(xiàn)、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特性，再進(jìn)行安全操作。產(chǎn)品僅用于科研

（2）通常購(gòu)買(mǎi)試劑時(shí)一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理。

（3）萬(wàn)一試劑操作者并非專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。必須在專(zhuān)業(yè)人士的指導(dǎo)監(jiān)督下進(jìn)行操作。對(duì)于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理。

（4）購(gòu)買(mǎi)后，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項(xiàng)；做好預(yù)防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項(xiàng)，做好必要的安全對(duì)策；對(duì)沒(méi)有標(biāo)明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進(jìn)行操作；必須帶好防護(hù)用具，小心翼翼進(jìn)行操作。