核酸提取及纯化试剂盒-上海邦景实业有限公司

产地	国产	加工定制	是

特点优势：

1.特异性：所有产品使用的引物均经过详尽的生物信息学分析，经过GenBank及自建庞大数据库的比对，确保所用的每一条引物均为种属或血清型特异的基因序列区段，可实现对细菌种属及血清型的特异检测，特异性均达到佳。

2. 重现性：该系列所有产品均经过大量实验菌株的验证，重现性为佳。

3. 灵敏性：该系列产品可实现对检测菌的高灵敏检测，当样品中细菌的浓度达到103cfu/ml时，可实现对其的直接检测，无需繁琐的增菌过程。

4. 实用性：检测范围广，涵盖了对人体危害较为严重的17种呼吸道及肠道致病菌，可实现对临床样品及其他环境取样的快速检测，整个检测过程为3-4个小时。

5. 优势1：序列资源丰富，除GenBank公布的序列外，公司还进行了大量菌株的序列破译，从理论上保证所选引物具有良好的保守性和特异性。

6. 优势2：该系列试剂盒均经过大量的保守性及特异性实验验证，凭借公司拥有的丰富的菌种资源，每一种检测试剂盒均经过了20余种标准菌株和临床菌株的保守性验证及40余种近缘标准菌株和临床菌株的特异性验证，确保在使用过程中不会出现任何的假阳性及假阴性报告结果。

提取步骤：

1.从负八十冰箱取出样品，放置于冰上缓慢解冻；（提前预冷离心机至4度）

2.待解冻后（红色），加入200 μl氯仿（加入氯仿体积为Trizol体积的1/5），剧烈震荡（乳白红色），冰上静置10 min。（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相。）

3.放置于预冷离心机，离心（4度，12000 rpm，15 min），离心后可见明显分三层（上层无色透明水相为RNA层，中间很薄的乳白色为DNA层，下层为红色为蛋白层）。

4.小心缓慢吸取上清，约400 μl（宁可少吸，也不要多吸取），置于另一个新的1.5 ml RNase-free EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，常温静置放置15 min。

5.离心（4度，12000 rpm，15 min），可见白色沉淀（有时细胞较少看不到沉淀，可放置负二十或负八十两小时再继续后面步骤）

6.弃上清，每管加入950 ul 75% 乙醇，上下颠倒混匀（切记不要用枪吹打混匀，这样会造成RNA溶解）。

7.离心（4度，12000 rpm，10 min），可见底部明显白色沉淀。

8.离心后，弃掉上清，放入离心机再次瞬离，用10 μl 的移液器洗去残留液体，开盖晾干（约5 min）。

9.每个样品根据沉淀大小加入适量DEPC水（一般20~30 μl，有时看不到沉淀，可加10 μl DEPC水溶解），吹打溶解RNA，十一楼酶标仪测浓度，OD值（260/280=1.8-2.0）标记，负八十保存。

备注：对于中性粒细胞提取RNA建议细胞数目大于2x106/样品；

备注：操作过程中佩戴口罩。

PCR反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是末及倒数个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。