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PCR試驗(yàn)要注意以下幾點(diǎn)：
引物規(guī)劃可能是PCR擴(kuò)增成功zui要害的要素。如引物規(guī)劃欠佳，可能致使擴(kuò)增產(chǎn)品缺乏，乃至擴(kuò)增失利，其原因是規(guī)劃欠佳的引物可致使非特異擴(kuò)增和/或構(gòu)成引物二聚體，此又成為PCR反響的競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)品，然后進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)品構(gòu)成。
在引物規(guī)劃時(shí)有必要思考以下幾個(gè)要素，其間zui主要的是引物長(zhǎng)度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補(bǔ)疑問(wèn)、G/C含量和多嘧啶（T,C）或多嘌呤（A,G）延伸、3’-結(jié)尾序列等。
（1）引物長(zhǎng)度：因?yàn)镻CR反響的特異性、退火溫度以及時(shí)刻均zui少有些與PCR引物長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)，因而引物長(zhǎng)度是PCR擴(kuò)增是不是成功要害的要素。通常PCR引物長(zhǎng)度為15-30核苷酸。
（2）引物序列互補(bǔ)：規(guī)劃引物時(shí)應(yīng)肯定沒(méi)有3個(gè)堿基以上的內(nèi)引物配對(duì)，如引物有這么具有自我配對(duì)的區(qū)域，“彈回”即有些雙鏈構(gòu)造將發(fā)作在退火反響時(shí)。
（3）G/C含量和多嘧啶（T,C）或多嘌呤（A,G）延伸：待挑選的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意散布，G+C含量均勻-防止長(zhǎng)A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量通常為45％-55％。在挑選的引物序列中應(yīng)沒(méi)有多G或多C延伸，因其可推進(jìn)非特異性退火，多A和多T延伸也應(yīng)防止，因其可“呼吸”和使引物－模板復(fù)合物展開(kāi)延伸，下降擴(kuò)增的功率。同時(shí)多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應(yīng)被防止。
（4）溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開(kāi)H鍵，使雙鏈DNA分開(kāi)或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指派一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式核算：Tm＝2（A+T）+4（G+C）。
需注意PCR反響zui少有兩個(gè)（一對(duì)）引物，兩個(gè)寡核苷酸引物Tm值應(yīng)對(duì)比接近，不可區(qū)別過(guò)大。因有較高的Tm值的引物在較低的反響溫度時(shí)可發(fā)作錯(cuò)配，而引物Tm值較低，反響溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)作效果，因而如引物的Tm值區(qū)別較大，可致使PCR擴(kuò)增功率低下乃至擴(kuò)增失利。
（5）3’-結(jié)尾序列：為操控引物錯(cuò)配，應(yīng)仔細(xì)地?cái)喽≒CR引物中3’結(jié)尾的方位。
言而總之，應(yīng)注重PCR引物規(guī)劃，規(guī)劃PCR引物時(shí)應(yīng)仔細(xì)當(dāng)心。關(guān)于一個(gè)成功的PCR來(lái)說(shuō)，幾個(gè)主要要素如引物長(zhǎng)度、GC含量和3’序列有必要優(yōu)化。抱負(fù)的引物應(yīng)為差不多隨意散布的核苷酸混合、GC含量50％、長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，因而能使Tm值處于56-62ºC規(guī)模。剖析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)思考無(wú)單聚合體,沒(méi)有顯著的二級(jí)構(gòu)造構(gòu)成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒(méi)有顯著的同源性。為防止枯燥無(wú)味的規(guī)劃，節(jié)省時(shí)刻，削減錯(cuò)誤，可應(yīng)用核算機(jī)程序優(yōu)化規(guī)劃、挑選、斷定寡核苷酸引物。
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