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閱讀：970發(fā)布時(shí)間：2017-8-10
HRPzui常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環(huán)吖嗪）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4—氨基*：*耦聯(lián)底物對等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種方式的反響：①氧化復(fù)原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一個(gè)氨基芳香劑與另一個(gè)芳香基化合物的氧化耦聯(lián)，如4—氨基*：*等。
（一）氧化復(fù)原色原底物
OPD被以為是HRPzui為活絡(luò)的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫（H202）
氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右時(shí)，DAB在波長450nm處有廣規(guī)模的zui大吸收，當(dāng)pH值降為1．0時(shí)，zui大吸收波長移動至492nm，一起摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深（圖4—2）。因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸停止反響。實(shí)踐工作中，用強(qiáng)酸尤其是鹽酸停止反響后，顯色并不安穩(wěn)，常隨時(shí)刻增加而色彩加深，這是因?yàn)榉错懞笫Ｏ碌倪^氧化氫繼續(xù)氧化OPD而發(fā)作非酶催化的DAB的成果。有人在強(qiáng)酸反響停止液中參加復(fù)原劑如亞硫酸鈉，因復(fù)原劑可敏捷*地將剩下的過氧化氫復(fù)原而阻撓了OPD的非酶氧化，成果顯色安穩(wěn)，數(shù)十小時(shí)內(nèi)不變，并且無需避光。OPD的缺點(diǎn)是其對機(jī)體具有致驟變作用。因?yàn)镺PD的不安穩(wěn)性，現(xiàn)在的產(chǎn)品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用時(shí)再溶解于相應(yīng)的緩沖液。
在ELISA測守時(shí)，OPD色原底物的詳細(xì)配方為①顯色底物溶液：在0．1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②停止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亞硫酸鈉）；③測定波長：492nm。
TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產(chǎn)品聯(lián)苯醌在波長450nm處有zui大消光系數(shù)，如果HRP量少，*和TMB過量時(shí)，則構(gòu)成藍(lán)色的陽離子根。下降pH，即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌（圖4—3）。運(yùn)用硫酸作為停止劑可使產(chǎn)品安穩(wěn)90min，但隨后本底顯色就不斷加深，國內(nèi)有人以為運(yùn)用1％SDS作為停止劑，可使鮮藍(lán)色24h內(nèi)堅(jiān)持不變，陰陽性比照非常顯著，但在我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)1％SDS對上述顯色有較強(qiáng)的褪色作用，現(xiàn)在仍以硫酸作為停止劑較為理想。ELISA中，底物反響顯色后，常挑選其具zui大吸收的波長450nm比色測定成果。而’Madersbacher和Berger等為進(jìn)步以TMB作底物的ELISA測定的活絡(luò)性，挑選顯色呈指數(shù)加深時(shí)的波長405nm比色測定。他們首要測定一系列已知濃度的規(guī)范品在450nm和405nm的值，證實(shí)A450nm／A405nm之比為3．2，然后在運(yùn)用波長405nm測定含低濃度待測物的標(biāo)本得到的OD值再乘以常數(shù)3．2，即為待測標(biāo)本在波長450nm處的真值。該種雙波長測定辦法可使ELISA測定規(guī)模進(jìn)步3倍。TMB的顯色反響雖與OPD一樣同屬氧化復(fù)原反響，但前者的反響是可逆的，如停止液中存在復(fù)原劑（*及亞硫酸鈉、SDS等），則可反響顯色敏捷衰退。TMB盡管溶解度相對較低，但因?yàn)槠涓邫z測活絡(luò)性及無致驟變作用，現(xiàn)已基本上替代了OPD而成為HRPzui為常的色原底物。
在產(chǎn)品ELISA試劑盒尤其是國內(nèi)的產(chǎn)品中，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態(tài)試劑，其間一種是含必定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對不安穩(wěn)的特點(diǎn)，因而，我們在運(yùn)用ELISA試劑盒時(shí)，如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B呈現(xiàn)色彩，或二者各取一滴混合后顯色，闡明該試劑盒的底物溶液已蛻變或已受污染，有必要拋棄。
在ELISA測守時(shí)，TMB色原底物的詳細(xì)配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0．1 mol／L的濃度溶于二甲亞砜，然后，再將其以1 mmol／L和H202以3．0 mmol／L的濃度溶于0．2mol／L醋酸鈉／枸櫞酸緩沖液（pH4．0），即可使用。②停止液：2 mol／L硫酸。③測定波長：450nm。
ABTS也是HRP的一種高活絡(luò)底物。在H：O：存鄙人，ABTS的氨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橐装l(fā)作歧化的陽離子根（圖4—4）。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產(chǎn)品相比更適于可見光測定（測定波長入＝414nm）。上述顯色也不安穩(wěn)，10 mmol／L疊氮鈉是較為理想的停止劑，可使顯色安穩(wěn)數(shù)十小時(shí)，且可削減陽離子根的歧化。另有人報(bào)導(dǎo)用1．25％NaF停止反響作用較好。
ABTS在現(xiàn)在國內(nèi)的ELISA試劑盒中基本上沒有使用，但在國外ELISA試劑盒偶見有使用。
在ELISA測守時(shí)，ABTS色原底物的詳細(xì)配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol／L和H202以2．5 mmo!／L的濃度溶于0．1 mol／L醋酸鹽緩沖液（pH 4．2），即可使用；②停止液：10 mmol／L疊氮鈉；③測定波長；414nm或405nm。
除上述三種外，HRP的氧化復(fù)原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等。
（二）氧化耦聯(lián)色原底物對
HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對主要有4—氨基*：*耦聯(lián)底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存鄙人，4—氨基*和*經(jīng)HRP作用縮合構(gòu)成赤色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）。
該耦聯(lián)色原底物對用于固相ELISA時(shí)，活絡(luò)性一般較低，反響見光不安穩(wěn)，并且*易發(fā)作多聚化，缺少恰當(dāng)?shù)姆错懲Ｖ箘?。因而，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標(biāo)的酶法檢測使用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作符號酶的均相酶免疫實(shí)驗(yàn)，可用甲醛停止反響。但這種辦法僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，這以后也未見有其他實(shí)驗(yàn)室的使用報(bào)導(dǎo)，可能還有其固有的缺點(diǎn)。
4—氨基*：*耦聯(lián)底物對色原底物的詳細(xì)配方為①顯色底物溶液：將4—氨基*以2 mmol／L，*以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2），即可使用；②停止液：未見報(bào)導(dǎo)；③測定波長：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍(lán)色的吲達(dá)胺（indamine），zui大吸收波長為590nm，見光不安穩(wěn)。用鹽酸或硫酸停止反響后，pH應(yīng)為3．0左右，pH值的下降使顯色從紫藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{(lán)色，zui大吸收波長從590nm變?yōu)?95nm，但是pH值的進(jìn)一步下降，將導(dǎo)致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯(lián)對在固相ELISA測定幾乎沒有使用。
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