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仇偉，徐波
Flash純化柱是Flash純化體系的心臟，好比汽車?yán)锏陌l(fā)動(dòng)機(jī)。工欲善其事，必先利其器，挑選正確的Flash純化柱是整個(gè)純化zui為關(guān)鍵的一環(huán)。而挑選合適的Flash純化柱就像茫茫的人海中挑選另一半一樣，高矮胖瘦、外貌、內(nèi)涵品質(zhì)各方面都要細(xì)細(xì)斟酌考慮。今天我們就聊聊純化柱的內(nèi)涵——固定相。
圖1. 常州三泰科技有限公司SepaFlash系列純化柱產(chǎn)品
固定相也就是俗稱的填料，是色譜中zui為核心的部分。要確定Flash純化柱裝填的固定相，就要依次確定固定相三個(gè)方面的信息：基質(zhì)種類、表面修飾/鍵合相、基質(zhì)參數(shù)。
一、基質(zhì)
基質(zhì)是固定相構(gòu)成的基本材料，常用的基質(zhì)材料分為三大類：無機(jī)材料、有機(jī)材料以及復(fù)合材料。無機(jī)材料有：硅膠、氧化鋁等；有機(jī)材料主要是凝膠等聚合物材料；復(fù)合材料通常是指無機(jī)材料與有機(jī)材料通過雜化、涂覆、包覆等手段相結(jié)合的復(fù)合材料。
硅膠是在Flash純化中應(yīng)用zui廣泛的基質(zhì)，色譜用硅膠是多孔結(jié)構(gòu)，具有高機(jī)械強(qiáng)度以及熱穩(wěn)定性，優(yōu)良的孔結(jié)構(gòu)和比表面積，其表面含有大量的活性羥基，在正相純化體系中對(duì)化合物的分離純化起到非常重要的作用。同時(shí)硅膠表面容易修飾形成其他鍵合類固定相，以硅膠基質(zhì)修飾而成的固定相種類繁多，且分離純化效果相比其他基質(zhì)好很多。但硅膠基質(zhì)在堿性條件下穩(wěn)定性比較差，同時(shí)其羥基的存在對(duì)一些物質(zhì)尤其對(duì)堿性物質(zhì)容易造成不可逆吸附，此外在應(yīng)用于一些生物分子樣品的分離純化時(shí)會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生非特異性吸附或使樣品變性，造成色譜圖中樣品洗脫的峰型變差以及樣品回收率降低。
氧化鋁基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定好，對(duì)一些化合物具有*的選擇性，對(duì)硅膠基質(zhì)來說具有很好的互補(bǔ)性。但氧化鋁表面修飾比較困難，所以zui多還是應(yīng)用于正相純化體系，少量應(yīng)用在離子交換體系。
有機(jī)基質(zhì)多是聚合物凝膠材料（如樹脂、聚苯乙烯二乙烯共聚物等），與硅膠相比有更好的化學(xué)穩(wěn)定性（適用pH值范圍可以從1到12），與待分離的樣品基本不發(fā)生變性反應(yīng)，也不容易產(chǎn)生不可逆吸附。通過修飾后應(yīng)用在離子交換色譜、體積排阻色譜和反相疏水色譜等模式下，在蛋白質(zhì)、糖類等生物分子的分離純化方面有著廣泛的應(yīng)用。但相比較硅膠等無機(jī)基質(zhì)來說，有機(jī)基質(zhì)固定相能耐受的分離機(jī)械強(qiáng)度較低，分離純化效果較差，限制了其在純化方面的應(yīng)用范圍。
復(fù)合基質(zhì)是兼容并中和了無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)，但一般復(fù)合基質(zhì)相應(yīng)的固定相都是價(jià)格昂貴，所以在制備純化方面應(yīng)用較少。
二、表面修飾/鍵合相
通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行修飾或者鍵合不同的基團(tuán)，形成了不同分離類型的固定相，通常包括：正相、反相、離子交換、尺寸排阻、手性等等固定相。
基質(zhì)上修飾的基團(tuán)極性大于流動(dòng)相的極性的色譜模式稱之為正相色譜，依靠樣品極性不同在固定相和流動(dòng)相產(chǎn)生分配的作用達(dá)到分離的目的。這種分離模式下，樣品按照極性從弱到強(qiáng)依次從純化柱上被洗脫下來。常用正相固定相包括：未修飾的硅膠；二醇基、氨基、氰基等硅膠基質(zhì)固定相；氧化鋁等。正相硅膠固定相主要應(yīng)用在合成非極性或中等極性中間體等的初步純化，常規(guī)的流動(dòng)體系為正己烷/乙酸乙酯、二氯甲烷/甲醇等。其優(yōu)點(diǎn)是純化簡(jiǎn)單、樣品后處理簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)是分離性能不高（與反相固定相比較），重現(xiàn)性較差，且吸附性較強(qiáng)甚至對(duì)某類物質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附。此外，一些極性基團(tuán)（二醇基、氨基、氰基等）鍵合的正相固定相經(jīng)常應(yīng)用在反相條件下，對(duì)于在C18等反相固定相保留不強(qiáng)的極性化合物，可以獲得很好的分離純化效果。
氧化鋁固定相分為酸性、中性、堿性三種。酸性氧化鋁一般利用酸性溶劑進(jìn)行預(yù)處理，具有微弱陽離子特性，表面更易保留中性和帶負(fù)電荷的物質(zhì)，不能很好地保留帶正電荷的物質(zhì)，主要應(yīng)用在酸性色素、醛類、酸類化合物的分離純化。堿性氧化鋁通常利用堿性溶液進(jìn)行預(yù)處理，具有陰離子特性并有陽離子交換功能，對(duì)極性陽離子樣品具有強(qiáng)吸附作用，主要應(yīng)用于堿性色素、生物堿等堿性物質(zhì)的分離純化。而中性氧化鋁對(duì)樣品的酸堿性不敏感，主要應(yīng)用于苷、醛類和酯類等酸堿不穩(wěn)定化合物。
基質(zhì)上修飾的基團(tuán)極性小于流動(dòng)相極性的色譜模式稱之為反相色譜，這種分離模式下，樣品被洗脫下來的順序與正相模式正好相反：樣品按照極性從強(qiáng)到弱依次被洗脫下來。反相固定相多是以硅膠基質(zhì)鍵合不同鍵合相如C18、C8、C4、C1、苯基等固定相，廣泛應(yīng)用在天然產(chǎn)物、多肽以及蛋白質(zhì)等樣品的精制純化方面，具有分離效果、重現(xiàn)性好、使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。
尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一種根據(jù)樣品分子體積（流體力學(xué)體積）的大小進(jìn)行分離的色譜模式（參見圖2）。SEC可以細(xì)化分為凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography, GPC）和凝膠過濾色譜（Gel Filtration Chromatography, GFC），基質(zhì)不同，故使用的流動(dòng)相也不相同。GPC目前主要的基質(zhì)是交聯(lián)PS(苯乙烯-二乙烯基苯聚合物)、交聯(lián)PVAC（交聯(lián)聚乙酸乙烯酯），不同基質(zhì)用不同的有機(jī)溶劑（DMF等）作為流動(dòng)相，主要應(yīng)用于合成有機(jī)高分子聚合物的分離純化。GFC主要基質(zhì)是表面親水處理的硅膠以及交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺等等，流動(dòng)相主要是水，所以GFC比較多的應(yīng)用在蛋白純化。尺寸排阻模式主要的缺點(diǎn)是載樣量很小，且流速通常比較低，所以制備效率差；而其分離模式簡(jiǎn)單、高回收率是它在制備純化方面的優(yōu)勢(shì)。
圖2. SEC分離模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊(cè)）
離子交換色譜是通過樣品分子表面離子電荷與色譜填料表面離子電荷互相作用而達(dá)到分離的模式（參見圖3）。固定相表面呈正電荷，對(duì)陰離子有保留的稱為陰離子交換填料；固定相表面呈負(fù)電荷，對(duì)陽離子有保留的稱為陽離子交換填料。此外根據(jù)填料表面離子結(jié)合狀態(tài)的強(qiáng)弱還分為強(qiáng)離子交換填料和弱離子交換填料。陽離子交換填料常見的表面基團(tuán)為磺酸基（強(qiáng)陽離子交換）、磷酸基、羧酸基、酚羥基；陰離子交換填料常見的表面基團(tuán)為伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基（強(qiáng)陰離子交換填料）。而離子交換填料應(yīng)用于制備純化時(shí)通常采用的基質(zhì)是樹脂，而分析應(yīng)用中出于壓力和分辨率方面的考慮硅膠基質(zhì)和無孔凝膠比較多。
圖3. 陰離子交換模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊(cè)）
手性固定相是將多糖、環(huán)糊精、蛋白等衍生物鍵合或者涂覆到硅膠等基質(zhì)上的固定相，對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行手性識(shí)別拆分，達(dá)到分離純化的目的。由于手性固定相非常昂貴，為了盡量保護(hù)固定相，一般對(duì)樣品化學(xué)純度要求比較高，通常樣品都經(jīng)過初步純化，提高化學(xué)純度，除去易對(duì)固定相造成損傷或吸附的雜質(zhì)。
三、基質(zhì)參數(shù)
基質(zhì)參數(shù)包括基質(zhì)的形狀、粒徑以及孔徑等，這些參數(shù)要結(jié)合純化方面的具體需求進(jìn)行選擇。
以應(yīng)用zui廣泛的硅膠基質(zhì)為例，應(yīng)用于制備純化方面的硅膠基質(zhì)通常分為球形和無定型兩種（參見圖4）。無定型硅膠價(jià)格低廉，是初步粗純的。與無定型硅膠相比，球型硅膠優(yōu)勢(shì)非常明顯，具有以下優(yōu)點(diǎn)：顆粒均一性好，裝填后柱床穩(wěn)定不容易塌陷，多路擴(kuò)散效應(yīng)低，柱效高，分離度好。但其價(jià)格稍微昂貴一點(diǎn)，一般應(yīng)用在精制純化階段。
圖4. 無定型硅膠與球形硅膠電鏡圖
基質(zhì)粒徑大小直接影響柱效和分離效果，越小的粒徑所能達(dá)到的柱效越高，而選擇粒徑要具體看樣品的分離狀況，畢竟制備要考慮成本問題，越小粒徑的固定相價(jià)格越昂貴，為了達(dá)到的柱效通常越小粒徑選擇的線流速就越大，所以背壓越高，對(duì)儀器要求也高。一般粗純的時(shí)候多選擇大顆粒固定相，而當(dāng)樣品附加值高，要求高純度和高得率的情況下，大多選擇小粒徑固定相。所以選擇固定相粒徑要從成本、樣品以及純化設(shè)備參數(shù)等方面綜合考慮。圖5所示為不同粒徑分離效果對(duì)比的案例。
圖5. 某中間體的分離效果圖（左圖所用Flash柱規(guī)格為25g 正相標(biāo)準(zhǔn)快速分離硅膠柱，粒徑40–63 µm；
右圖所用Flash柱規(guī)格為25g 正相快速分離硅膠柱，粒徑25–40 µm）
多孔固定相基質(zhì)孔徑的選擇主要是從樣品的分子體積去考慮（表1總結(jié)了樣品分子量、樣品分子直徑以及推薦孔徑之間的關(guān)系），固定相的孔徑通常要大于樣品分子體積的三倍，才能使樣品分子有效進(jìn)入固定相孔內(nèi)進(jìn)行充分的接觸達(dá)到分離效果。但是對(duì)于多肽類樣品分子而言，由于其分子結(jié)構(gòu)呈長(zhǎng)鏈狀，因而固定相的孔徑不必滿足上述規(guī)律。同時(shí)孔徑還與比表面積有關(guān)，其他參數(shù)一樣的情況下孔徑越小比表面積越大，而比表面積的大小在一定程度上影響分離效果和上樣情況，通常比表面積大代表表面修飾的基團(tuán)多，那么分離效果就越好，載樣量也越大。
表1. 樣品分子量、樣品分子體積以及對(duì)應(yīng)的推薦孔徑
四、總結(jié)
綜上所述，在進(jìn)行樣品的Flash純化制備時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際的制備需求，結(jié)合樣品性質(zhì)、對(duì)產(chǎn)物純度和得率方面的要求以及儀器配置等方面的實(shí)際情況，從基質(zhì)、表面修飾/鍵合相以及基質(zhì)參數(shù)三個(gè)方面綜合考慮，zui終確定純化制備zui適用的固定相。
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