脾多肽對非霍奇金淋巴瘤患者
漿細胞樣樹突狀細胞功能及成熟的影響
凡治國，李志平，崔東海，任 超
( 安陽市腫瘤醫(yī)院普內(nèi)科，河南 安陽 455000)

［摘要］ 目的 探討脾多肽對非霍奇金淋巴瘤( NHL) 患者漿細胞樣樹突狀細胞( pDC) 功能及成熟的影響。方法  收集35 例NHL 患者外周血單個核細胞，采用流式細胞儀分選 pDC，用脾多肽刺激 pDC 5 d，顯微鏡觀察pDC 形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測 pDC 表型，掃描電鏡觀察 pDC 超微結(jié)構(gòu)，不同濃度的脾多肽處理24 h 后，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測 pDC 上清液中干擾素 － α( IFN-α) 、腫瘤壞死因子 － α( TNF-α) 和白介素 － 6( IL-6) 水平。以 35 例同期體檢健康志愿者作為對照。結(jié)果  經(jīng)不同濃度的脾多肽處理后，pDC 的表面突起逐漸明顯，隨著脾多肽濃度的增加，突起明顯變長呈成熟特征;各濃度脾多肽組 pDC 上清液中 IFN-α、TNF-α、IL-6 水平均較脾多肽 0  mg·L － 1 組有明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ，且隨著脾多肽濃度的增加而上升明顯，各濃度脾多肽組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05);各濃度脾多肽組 pDC 細胞的 CD11c、CD80、CD86 表達陽性率均較脾多肽 0  mg·L － 1 組有明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ，且隨著脾多肽濃度的增加而上升明顯，各濃度脾多肽組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05)。結(jié)論 脾多肽可以有效增強 NHL 患者 pDC的功能，對其分化成熟有很好的促進作用。

［關(guān)鍵詞］ 脾多肽;非霍奇金淋巴瘤;漿細胞樣樹突狀細胞
DOI: 10． 3969 / j． issn． 1673-5412． 2018． 03． 012
［中圖分類號］ Ｒ733． 1 ［文獻標識碼］ A ［文章編號］ 1673 － 5412(2018)03 － 0221 － 04
Effect of Spleen Polypeptide on the Function and Maturation of Plasma Cell Dendritic Cells in the Patients with Non-Hodgkin’s Lymphoma
FAN Zhiguo，LI Zhiping，CUI Donghai，ＲEN Chao
( Department of Medical Oncology，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China)
［Abstract］ Objective To investigate the effect of splenic polypeptide on the function and maturation of plasma cell dendritic cells in  patients  with  non-Hodgkin’s  lymphoma  ( NHL)． Methods Peripheral  blood  mononuclear cells from 35  patients with NHL were selected． Pulp-like dendritic cells ( pDC) were sorted by flow cytometry，and were treated with splenic polypeptide for 5 days． The expression of pDC was detected by immunohistochemistry． The expression of pDC was detected by flow cytometry． The expression of pDC was detected by electron microscope． The expressions of interferon-α ( IFN-α) ，tumor  necrosis  factor-α  ( TNF-α) and  interleukin-6  ( IL-6) in  the  pDC  su- pernatant were detected by  enzyme  linked  immunoadsorption  test． The 35  healthy  volunteers  at  the  same  age  were used as controls． Ｒesults The  expressions  of  IFN-α，TNF-α  and  IL-1  in  all  the  pDC  supernatant  treated  with splenic polypeptide groups were significantly higher than those of the no splenic polypeptide group ( P ＜ 0． 05) ，and were increased with the increase of spleen peptide concentration． The  positive  rates  of  CD11c，CD80  and  CD86  in the pDC supernatant treated with splenic polypeptide groups were significantly higher than those of the no splenic polypeptide group ( P ＜ 0． 05) ，and were increased with the increase of spleen peptide concentration． Conclusion Splenic peptide can effectively enhance the function of pDC in the patients with NHL，and it can promote the differ- entiation and maturation of the patients．
［Key  words］ spleen polypeptide; non-Hodgkin’s lymphoma; plasma cell-like dendritic cells

作者簡介:   凡治國(1978 － ) ，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事血液腫瘤的診斷與治療工作。E-mail:henanzyzz@ 163． com
非霍奇金淋巴瘤( non-hodgkin's  lymphoma，NHL)是一種發(fā)生于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，B 細胞來源者占 85% 以上，在惡性淋巴瘤中 NHL 所占的比例遠高于霍奇金?。?］。青壯年人群是 NHL 的高發(fā)人群，近年來的流行病學(xué)資料顯示其發(fā)病率和病死率逐年上升［2］。雖然放、化療技術(shù)取得很大的發(fā)展，但由于NHL 臨床特征變化多樣，病理類型又非常繁雜，故臨床治療仍存在很多難題［3 － 4］。免疫功能缺陷是 NHL 發(fā)病的高危因素之一，免疫調(diào)節(jié)異?？赡茉?NHL 的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
漿細胞樣樹突狀細胞( plasmacytoid dendritic cell， pDC) 是體內(nèi)專職性抗原呈遞細胞( antigen-presenting cell，APC) ，不僅激活初始型 T 細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且能啟動 T 細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，受細菌、病毒的刺激時產(chǎn)生一定數(shù)量的腫瘤壞死因子 － α( tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和白介素 － 6 ( interleukin-6，IL-6) ，并逐漸向樹突狀細胞( dendritic  cell，DC) 分化，在機體免疫中起重要作用［5 － 6］。以 DC 為基礎(chǔ)的主動免疫治療在腫瘤治療中受到人們重視，也成了目前研究的熱點。脾多肽是由多肽、游離氨基酸、核酸和總糖組成的一種 激活及增強機體免疫功能的藥物，對機體免疫有雙向 調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)節(jié)免疫、增強機體抵抗力、抗腫瘤及 提高骨髓造血功能等作用。目前尚沒有關(guān)于脾多肽對NHL 患者 pDC 功能及成熟的影響的報道，本研究采用流式細胞儀分選 pDC，用不同濃度的脾多肽刺激 pDC，觀察脾多肽對外周血來源的 pDC 功能及成熟的影響， 以期為 NHL 免疫治療提供依據(jù)。
1資料與方法
1． 1    研究對象  選擇 2015 年 6 月至 2016 年 10 月我院收治的 35 例 NHL 患者作為研究對象，所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診為 NHL，并處于緩解期。其中男 19例，女 16 例;年齡 15 ～ 59(30． 45 ± 12． 57) 歲;Ann  Ar- bor 分期:Ⅰa 期 8 例，Ⅱa 期 12 例，Ⅱb 期 7 例，Ⅲa 期 4 例，Ⅲb 期 2 例，Ⅳa 期 2 例。對照組為同期體檢健康志愿者，男 20  例，女 15  例; 年齡 18  ～ 60 ( 35． 5  ±
11． 5) 歲。
1． 2    儀器與試劑  FACSCalibur 流式細胞儀( 美國BD公司);JSM6510 掃描電子顯微鏡( 日本電子株式會社);JXP15 型光學(xué)顯微鏡( 上海光學(xué)儀器廠);Bio-Ｒad Model 680 酶標儀( 美國 Bio-Ｒad 公司)。脾多肽注射液( 吉林豐生制藥有限公司，商品名: 澳蓮，批號: 15021021); 干擾素 － α( interferon-α，IFN-α) 、TNF-α、
IL-6 的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒均購自上海滬鼎生物科技有限公司;胎牛血清、ＲPMI-1640  培養(yǎng)基、PBS 購自上海哈靈生物科技有限公司;熒光標志的單克隆抗體CD4-FITC、CD123-FE、CD11c-FITC、CD86-APC、BD- CA-2-APC、CD80-PeCy5 及同型對照 IgG1 FITC / IgG1 -
PC5 購自美國 BD 公司。
1． 3 方法 收集 NHL 患者和對照組患者外周血各 2 mL，放入 EDTA-K2 抗凝管中，離心(2 000 r·min － 1 ， 20 min) ，收集單個核細胞，保存在 － 196 ℃ 液氮中待測。
1． 3． 1 pDC 分選和脾多肽刺激 將冷凍的單個核細胞解凍，依次加入適量的 CD4-FITC、BDCA-2-APC、CD123-FE 單抗，混合均勻后，應(yīng)用 FACSCalibur 型流式細胞儀分選，分選后的 pDC 存活率為 96． 5% ，純度為 96． 1% 。使用 PBS  調(diào)整分選后 pDC  密度至1 × 104 ·mL － 1 ，然后接種在潔凈的 24 孔平底培養(yǎng)板上， 將配制好濃度為 0、50、100、200 mg·L － 1 的脾多肽注射液分別加入到每組中，應(yīng)用含體積分數(shù) 5% CO2 孵箱 37  ℃ 條件下孵育 24  h，將每孔中的上清液收集起來，－ 20 ℃ 保存，待測。
1． 3． 2    pDC 形態(tài)觀察  應(yīng)用不同濃度脾多肽注射液刺激 5 d 后，將收集的上清液每個濃度組各取少部分染色，光鏡下觀察形態(tài)，然后在掃描電鏡下觀察。
1． 3． 3 外周血 pDC 檢測 取一支分選出的 pDC，用含有體積分數(shù) 10% 胎牛血清的 ＲPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋至 1 × 106 ·L － 1 ，接種在 48 孔培養(yǎng)板(500 μL / 孔) 中，每孔中加入 6 μmol · L － 1 的 PBS，體積分數(shù) 5% CO2 飽和濕度孵箱中 37 ℃ 條件下孵育 24 h，收集上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組 IFN-α、TNF-α、 IL-6 水平。
1． 3． 4    pDC 的表型檢測  采用流式細胞術(shù)檢測 pDC的表型，操作如下:1) 不同濃度脾多肽注射液刺激 5 d 后的 pDC，每種濃度各 1 管;2) 用 PBS 沖洗 2 遍;3) 在 4 ℃ 條件下用體積分數(shù) 10% 胎牛血清封閉細胞表面抗體 15 min;4) 加 PBS 調(diào)密度至 1 × 103 ·mL － 1 ;5) 取細胞懸液 100  μL，加入 CD11c-FITC、CD86-APC、BDCA- 2-APC、CD80-PeCy5 單抗各20 μL;6)4 ℃ 培育30 min;
7) 上機檢測。
1.4    統(tǒng)計學(xué)處理  采用 SPSS 19． 0 處理，計量資料用  x珋± s 表示，比較用 t 檢驗;計數(shù)資料用百分數(shù)表示，比較用 χ2 檢驗，檢驗水準 α = 0． 05。
2結(jié)果
2.1 不同濃度脾多肽處理后 pDC 形態(tài)變化分析 不

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